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一、實驗前應明確的問題
1. 選擇適當的細胞接種濃度。
一般情況下,96孔培養板的一內貼壁細胞長滿時約有105個細胞。但由于不同細胞貼壁后面積差異很大,因此,在進行MTT試驗前,要進行預實驗檢測其貼壁率、倍增時間以及不同接種細胞數條件下的生長曲線,確定試驗中每孔的接種細胞數和培養時間,以保證培養終止致細胞過滿。這樣,才能保證MTT結晶形成酌量與細胞數呈的線性關系。否則細胞數太多敏感性降低,太少觀察不到差異。
2. 藥物濃度的設定。
一定要多看文獻,參考別人的結果再定個比較大的范圍先初篩。根據自己初篩的結果縮小濃度和時間范圍再細篩。切記!否則,可能你用的時間和濃度根本不是藥物的有效濃度和時間。
3. 時間點的設定。
在不同時間點的測定OD值,輸入excel表,zui后得到不同時間點的抑制率變化情況,畫出變化的曲線,曲線什么時候變得平坦了(到了平臺期)那個時間點應該就是的時間點(因為這個時候的細胞增殖抑制表現的zui明顯)。
4. 培養時間。
200 ul的培養液對于10的4~5次方的增殖期細胞來說,很難維持68 h,如果營養不夠的話,細胞會由增殖期漸漸趨向G0期而趨于靜止,影響結果,我們是在48 h換液的。
5. MTT法只能測定細胞相對數和相對活力,不能測定細胞數。
做MTT時,盡量無菌操作,因為細菌也可以導致MTT比色OD值的升高。
6. 理論未必都是對的。
要根據自己的實際情況調整。
7. 實驗時應設置調零孔,對照孔,加藥孔。
調零孔加培養基、MTT、二甲基亞砜。對照孔和加藥孔都要加細胞、培養液、MTT、二甲基亞砜,不同的是對照孔加溶解藥物的介質,而加藥組加入不同濃度的藥物。
8. 避免血清干擾。
用含15%胎牛血清培養液培養細胞時,高的血清物質會影響試驗孔的光吸收值。由于試驗本底增加,會試驗敏感性。因此,一般選小于10%胎牛血清的培養液進行。在呈色后,盡量吸凈培養孔內殘余培養液。
二、實驗步驟
(一)貼壁細胞
1. 收集對數期細胞,調整細胞懸液濃度,每孔加入100 ul,鋪板使待測細胞調密度至1 000-10 000孔,(邊緣孔用無菌PBS填充)。
2. 5%CO2,37 ℃孵育,至細胞單層鋪滿孔底(96孔平底板),加入濃度梯度的藥物,原則上,細胞貼壁后即可加藥,或兩小時,或半天時間,但我們常在前一天下午鋪板,次日上午加藥.一般5-7個梯度,每孔100 ul,設3-5個復孔.建議設5個,否則難以反應真實情況。
3. 5%CO2,37 ℃孵育16-48小時,倒置顯微鏡下觀察。
4. 每孔加入20 ul MTT溶液(5 mg/ml,即0.5% MTT),繼續培養4 h。若藥物與MTT能夠反應,可先離心后棄去培養液,小心用PBS沖2-3遍后,再加入含MTT的培養液。
5. 終止培養,小心吸去孔內培養液。
6. 每孔加入150 ul二甲基亞砜,置搖床上低速振蕩10 min,使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD490 nm處測量各孔的吸光值。
7. 同時設置調零孔(培養基、MTT、二甲基亞砜),對照孔(細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞砜)。
(二)懸浮細胞
1. 收集對數期細胞,調節細胞懸液濃度1×106/ml,按次序將①補足的1640(無血清)培養基40 ul ;②加Actinomycin D(有毒性)10 ul用培養液稀釋 (儲存液100 ug/ml,需預試尋找*稀釋度,1:10-1:20);③需檢測物10 ul;④細胞懸液50 ul(即5×104cell/孔),共100 ul加入到96孔板(邊緣孔用無菌水填充)。每板設對照(加100 ul 1640)。
2. 置37 ℃,5%CO2孵育16-48小時,倒置顯微鏡下觀察。
3. 每孔加入10 ul MTT溶液(5 mg/ml,即0.5%MTT),繼續培養4 h。(懸浮細胞推薦使用WST-1,培養4 h后可跳過步驟4),直接酶聯免疫檢測儀OD570 nm(630 nm校準)測量各孔的吸光值)
4. 離心(1000轉x10 min),小心吸掉上清,每孔加入100 ul二甲基亞砜,置搖床上低速振蕩10 min,使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD570 nm(630 nm校準)測量各孔的吸光值。
5. 同時設置調零孔(培養基、MTT、二甲基亞砜),對照孔(細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞砜),每組設定3復孔。