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抗原修復技術在免疫組化中的應用

2013-4-15　　閱讀(1642)

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福爾馬林固定時，組織中的許多氨基酸殘基在分子內或分子間形成了醛鍵，使得不少抗原決定簇被封閉。同時，由于甲醛的聚合作用，使蛋白質分子間相互交聯形成大分子網絡，也導致了抗原決定簇被掩蓋，這就使得相當部分的抗原不能與抗體很好是進行反應。因此，抗原修復也是影響免疫組化染色結果的基本因素。

     在傳統標準方法,經脫蠟、脫水和用3%H2O2阻斷內源性過氧（化）物酶，石蠟切片經蒸餾水沖洗，放置在塑料Coplin缸中。加入AR液，如蒸餾水、緩沖液、金屬鹽液、尿素等，蓋上并置家用微波爐加熱5或10分鐘（注意防止切片干躁）。有時在加熱5分鐘后，間隔1分鐘，再加熱5分鐘（在*個5分鐘后檢測液體高度）。加熱后，從微波爐取出塑料Coplin缸，冷卻15分鐘。片子經蒸餾水沖洗二次后在PBS液中浸5分鐘，才進行IHC染色。為了保持一致的加熱條件，必須設定靠近微波爐中心相同的位置及同一編號的Coplin缸 ，按照不同的抗體設定不同的加熱時間，盡可能的建立標準的加熱條件。
     微波（MW）加熱過程如下：在盒內放入200ml檸檬酸緩沖液（PH6.0±0.1），并蓋上帶有小孔的蓋子，微波加熱至沸騰；將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫塑料切片架中，放入已沸騰緩沖液中，有作者提供做免疫組化時采用微波爐中等功率800W[3]，微波爐選用解凍檔的國產家用微波爐（根據目前的研究,建議用醫用微波爐），中檔繼續處理10-20分鐘；取出微波塑料缸冷卻至室溫，從緩沖液中取出玻片，片子經蒸餾水沖洗二次，之后用PBS（PH7.2-7.4）沖洗兩次，每次3分鐘。
盡管有少數作者[4]認為經高溫后冷卻這一步省略。在我們觀點，15分鐘的冷卻必須的幾點理由：1、如這一步省略，對于有些抗體而言，會降低AR-IHC染色強度。2、突然從高溫到低溫可導致組織片掉片。3、可能引起形態學的變化。
 
     總之,以高壓加熱方法、微波加熱方法較為穩定, 高壓加熱方法效果優于微波加熱方法和單純加熱方法。溶液的濃度對修復效果無任何影響，而PH值則影響較大。緩沖液以檸檬酸緩沖液和Tris-HCL較常用。前人的研究表明，溫度高修復時間短[6]。解放軍第251醫院根據臨床病理診斷、鑒別診斷和研究的實際需要，在抗原修復方法規范研究和應用的基礎上，創用了胰蛋白酶—尿素聯合消化技術、鹽酸水解暴露抗原技術和MW—表面活性劑Triton X—100（MW—TX）修復抗原技術 [7] ?？乖┞痘蚩乖迯头椒ㄝ^多，其中發MW—枸櫞酸緩沖液使用較多，效果。MW修復抗原的方法是石蠟切片脫蠟、水洗后放入修復液中，用250W的輸出功率2X5min，待冷卻至室溫按常規處理。目前AR過程已成功應用在BioTek全自動免疫組化染色儀中。
     用于IHC消化的酶很多，所選酶的種類，使用的濃度，PH值，消化時間及溫度等均要視組織固定的不同，所檢測抗原的性質、組織類型的不同而異，應通過預實驗摸索確定。使用酶消化的原則：胰蛋白酶和蛋白酶K一般用于細胞內抗原，如Keratin，CEA，GFAP等。胃蛋白酶則主要用于細胞間質抗原的檢測，如fibronectin，Laminin，各型膠原等。一般來言，消化時間和組織固定的長短呈正比。在用酶消化，熱修復后均不能獲得結果的前提下使用抗原修復與酶消化結合的方法，有時會取得較為滿意的結果。一般蛋白酶K和微波相結合，但應注意，可能檢測的抗原無論何種性質均會在核內出現假陽性反應[6]。

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