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實驗案例

現(xiàn)在的高通量測序平臺（主要是illumina）在直接測序時只能測出200bp長度的序列，因此建庫方案是將DNA .片段化為200bp，然后深度測序后，后將序列拼接。我公司自主研發(fā)的非接觸聚能式超聲波DNA打斷儀可以在不接觸樣品的情況下隔著EP管將細胞DNA鏈至打斷至200bp或是更小。

 

實驗目的：將收集的細胞DNA..片段化

樣品：鼠源乳腺癌細胞4T1

人源肝癌細胞HepG2

人源耐藥子宮肉瘤細胞MES-SA/DX5

 

實驗步驟：

• 交聯(lián)： 取1皿細胞（10 cm平皿），10 mL培養(yǎng)基中加入270 uL  37%甲醛，使得甲醛的終濃度為1%，輕輕搖勻，37℃ 孵育10 min。
• 終止交聯(lián)：加甘氨酸至終濃度為0.125 M。550 ul 2.5 M甘氨酸于平皿中。輕輕搖勻，在室溫下放置5 min即可。
•  棄凈培養(yǎng)基，用冰冷的含1 mM  PMSF 的PBS清洗細胞2次，每次5-10mL。
•  加入3 ml冰冷的含1mM  PMSF的PBS，細胞刮刀收集細胞于離心管中，用PBS清洗培養(yǎng)皿兩次，收集到離心管中。
•  預冷后2000 rpm離心 5 min收集細胞。
•  新鮮配置一定體積的蛋白酶抑制劑復合物和SDS Lysis Buffer，充分混勻。
•  棄上清，加入一定體積含有蛋白酶抑制劑復合物的SDS Lysis Buffer，重懸細胞。
•  冰上放置10min。
•  開啟冷循環(huán)泵，并降溫至4℃以下。
•  開啟超聲波DNA打斷儀，將程序調制循環(huán)模式，超聲20s停10s。 
•  啟動機器至超聲結束。
•  加解交聯(lián)試劑65℃ 解交聯(lián)4h以上，可過夜解交聯(lián)。
•  將超聲過的樣品提取DNA. 片段。
•  1.5%-2%瓊脂糖凝膠電泳15min。
•  拍照。

人源骨肉瘤細胞U2OS