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胰腺癌是一種毀滅性的疾病。在過去的幾十年里，這種癌癥的5年總生存率仍然不足5%，未發(fā)生較大變化，目前它是西方國家癌癥相關(guān)死亡的第四大原因。手術(shù)仍然是有可能治愈這種癌癥的方法，但只有約20%的患者在診斷時處于手術(shù)可切除的疾病階段。在先進(jìn)的治療方法下，手術(shù)可切除的患者的中位總生存期為26個月，然而已發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者的中位總生存期為不到6個月。因此，對新治療方案的需求尚未得到滿足。嵌合抗原受體（CAR）T細(xì)胞（CAR-T）是一種新的有前途的治療方法。對胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）進(jìn)行有效細(xì)胞免疫治療的一個主要障礙是缺乏合適的腫瘤特異性抗原。

在一項(xiàng)新的研究中，德國研究人員進(jìn)行了經(jīng)驗(yàn)性篩選旨在發(fā)現(xiàn)治療PDAC的CAR候選靶標(biāo)，確定了四個候選靶標(biāo)：CLA、TSPAN8、CD66c和CD318。他們發(fā)現(xiàn)CLA在上皮性腫瘤上表達(dá)。

到目前為止，CLA只被認(rèn)為是一種*的皮膚歸巢受體，在T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、朗格漢斯細(xì)胞、單核細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的亞群中表達(dá)。它是SELPLG蛋白的一種特殊的糖基化形式，通過與E-選擇素、L-選擇素和P-選擇素結(jié)合在免疫細(xì)胞的組織浸潤中起作用。由于它只在這些細(xì)胞類型的亞群上表達(dá)，這些作者推測它可能是一個合適的CAR-T細(xì)胞靶標(biāo)，具有可接受的腫瘤外毒性。然而，由于它的表達(dá)在活化的T細(xì)胞上發(fā)生上調(diào)，它構(gòu)成了產(chǎn)生功能性CAR-T細(xì)胞的一個技術(shù)障礙。CLA特異性CAR-T細(xì)胞的表現(xiàn)更差，這凸顯了CAR-T細(xì)胞對自身抗原特異性的內(nèi)在問題。科學(xué)家們?yōu)檫@個問題開發(fā)了潛在的解決方案。一些人建議用CRISPR/Cas介導(dǎo)的方法敲除T細(xì)胞內(nèi)的抗原，另一些人則主張利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留結(jié)構(gòu)域與自身抗原特異性的scFv結(jié)合，將自身抗原捕獲到T細(xì)胞中。

其他確定的候選靶標(biāo)CD66c、CD318和TSPAN8已被描述為在一些癌癥實(shí)體中過度表達(dá)。結(jié)合這些作者的抗體驅(qū)動的篩選、全面的生物信息學(xué)分析和免疫熒光分析，他們增加一個重要的知識，即這些候選靶標(biāo)的表達(dá)不僅在PDAC腫瘤細(xì)胞中高度富集，而且在人體中的腫瘤外表達(dá)也受到限制。這種方法的有效性的一個強(qiáng)有力的支持是，他們確定了已經(jīng)用于CAR-T細(xì)胞治療的靶標(biāo)，如CEACAM5（CEA）或PROM1（CD133）。

鑒定PDAC CAR候選靶標(biāo)，

這些作者在體外評估了32種在scFv定位和間隔區(qū)長度上存在差異的CAR構(gòu)建體。對CD318和CD66c而言，較短的間隔區(qū)顯示出最高的功能性，而基于較長間隔區(qū)的TSPAN8特異性CAR構(gòu)建體表現(xiàn)更好。CD318具有最長的細(xì)胞外氨基酸鏈（638），其次是CD66c（320）和TSPAN8（24和96）。盡管對scFvs的確切表位和細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)缺乏了解，但是這些發(fā)現(xiàn)很好地與以前的調(diào)查相吻合，指出較長的間隔區(qū)對膜近端表位有優(yōu)勢，反之亦然。

此外，這些作者發(fā)現(xiàn)，在兩個獨(dú)立的臨床前研究中，他們的四種體外表現(xiàn)*CAR構(gòu)建體也表現(xiàn)出了抗腫瘤的功效。CD318 XS Vh-Vl CAR和TSPAN8 S Vh-Vl CAR被證實(shí)是非常有前途的候選CAR，基于它們的高效力，可以進(jìn)一步進(jìn)行臨床前評估和潛在的臨床評估。在兩種異種移植模型的一種中，CD66c S Vl-Vh CAR在體外療效方面要落后些，但仍能誘導(dǎo)疾病穩(wěn)定。

這些作者發(fā)現(xiàn)CD66c特異性CAR-T細(xì)胞的活性下降不是由于靶標(biāo)下調(diào)引起的，而且脾臟中的CAR-T細(xì)胞數(shù)量與其他治療組無關(guān)，因此排除了持久性這個問題。在腫瘤部位，他們發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞和CAR-T細(xì)胞的浸潤減少，這表明CAR-T細(xì)胞的浸潤和潛在激活可能受到損害。其他研究已表明，抗原非依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（tonic signaling）可導(dǎo)致體外和體內(nèi)研究中的這種差異。然而，他們沒有觀察到與靶標(biāo)陰性細(xì)胞共培養(yǎng)的CAR-T細(xì)胞的背景激活。當(dāng)改用基于CD66c XS的CAR構(gòu)建體時，他們發(fā)現(xiàn)這種CAR構(gòu)建體在體內(nèi)的表現(xiàn)更出色，盡管在體外只觀察到微小的差異。一個主要的區(qū)別是就XS構(gòu)建體而言，IL-2和其他細(xì)胞因子的釋放更出色。據(jù)觀察，IL-2的產(chǎn)生表明有一種適當(dāng)?shù)墓δ苄怨泊碳そY(jié)構(gòu)域。此外，IL-2在實(shí)現(xiàn)共刺激信號對T細(xì)胞生存、增殖和體內(nèi)持久性的積極作用中起著關(guān)鍵作用。

在可能的臨床轉(zhuǎn)化方面，這些作者發(fā)現(xiàn)CD66c和CEA的重疊表達(dá)，使其成為一個有趣的候選靶標(biāo)。事實(shí)上，已經(jīng)證明CD66c比CEA在惡性組織中更多地過度表達(dá)。這一發(fā)現(xiàn)可能有助于制造微調(diào)的CAR，以便能夠區(qū)分腫瘤細(xì)胞和健康細(xì)胞的不同表達(dá)水平。然而，CD66c在中性粒細(xì)胞和其他髓樣細(xì)胞上的表達(dá)水平凸顯了通過血液中大量的CAR-T細(xì)胞反應(yīng)性誘發(fā)嚴(yán)重的細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS）的風(fēng)險，這在用CD19特異性CAR-T細(xì)胞治療的B-ALL患者中觀察到，特別是在腫瘤負(fù)荷高的患者中。

然而，雖然CRS和B細(xì)胞增生可以得到很好的治療，但中性粒細(xì)胞減少只能在一個很短的時間窗口內(nèi)被容忍，這使得CD66c成為一種高風(fēng)險的靶標(biāo)，至少在單靶標(biāo)特異性的CAR-T細(xì)胞方法中是如此。使用布爾邏輯門控（比如AND或NOT CAR構(gòu)建體）的組合方法可能會提供一個替代方案來規(guī)避預(yù)期的毒性。這些作者發(fā)現(xiàn)與CD318的組合可能是他們的候選靶標(biāo)中的*。在這方面，已有的靶標(biāo)（如MSN或CD133）和這項(xiàng)研究描述的靶標(biāo)的組合，也將擴(kuò)大特異性靶向胰腺腫瘤細(xì)胞的CAR庫。進(jìn)一步的替代選擇是開發(fā)區(qū)分腫瘤細(xì)胞和健康細(xì)胞表面上抗原表達(dá)水平的CAR，或者嚴(yán)格控制結(jié)合物的給藥時間和劑量的CAR，如抗FITC引導(dǎo)的CAR或UNI-CAR。此外，對CAR表達(dá)或激活進(jìn)行空間控制可能進(jìn)一步增加安全性。這些方法有可能克服在單一靶標(biāo)特異性CAR-T細(xì)胞中觀察到的在靶腫瘤外毒性（on-target off-tumor toxicities，即脫靶毒性）。

CD318和TSPAN8已被提出作為藥物療法或抗體驅(qū)動療法的靶標(biāo)。雖然之前的研究已顯示體外和體內(nèi)的腫瘤增長率下降或疾病穩(wěn)定，但這些作者的結(jié)果顯示腫瘤被**，這很可能歸于代表“活體藥物”的T細(xì)胞的細(xì)胞毒性。在B細(xì)胞惡性腫瘤中，這一點(diǎn)已被證明，即在先前的CD19特異性抗體治療失敗后，通過CD19特異性CAR-T細(xì)胞的施用實(shí)現(xiàn)了疾病的*緩解。然而，由于CAR-T細(xì)胞比抗體更有效，而且其藥代動力學(xué)難以預(yù)測和控制，因此必須謹(jǐn)慎管理，以應(yīng)對潛在的腫瘤外毒性。他們旨在預(yù)測組織面臨風(fēng)險的分析表明，CD318具有最有利的模式，在健康組織中幾乎沒有檢測到這種蛋白的表達(dá)。根據(jù)他們的結(jié)果，預(yù)測TSPAN8特異性毒性的最高風(fēng)險發(fā)生在胃腸道，特別是結(jié)腸，可能與靶向CEA的CAR所觀察到的相似。與CEA類似，使用另一種CAR-T細(xì)胞輸注途徑進(jìn)入肝動脈可能是克服這種潛在健康威脅的一個解決方案。此外，使用AND CAR策略有可能進(jìn)一步減少對結(jié)腸組織的毒性，CAR-T細(xì)胞只有在遇到CD318和TSPAN8時才被激活。

當(dāng)然，除了安全性之外，療效也必須在臨床上得到證明。這些作者發(fā)現(xiàn)，只有靶標(biāo)陽性的腫瘤細(xì)胞才能誘導(dǎo)T細(xì)胞激活。這些候選靶標(biāo)在人源腫瘤異種移植模型和原發(fā)性PDAC上偶爾表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式，這可能反映了PDAC的不同遺傳背景。然而，這與以前的PDAC CAR靶標(biāo)無關(guān)。這就提出了對預(yù)測療效的配套診斷工具的需求。最有可能的是，在患者活組織檢測中測得的靶標(biāo)表達(dá)將在這種高度個性化方法的未來發(fā)揮核心作用，這篇論文描述的循環(huán)免疫熒光（cyclic Immunofluorescence）方法可以幫助對患者進(jìn)行分層。

在靶向CD19的CAR療法中，盡管最初檢測到靶標(biāo)表達(dá)下調(diào)或丟失，但仍可能導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)。腫瘤通過抗原逃逸產(chǎn)生治療抵抗性的風(fēng)險取決于靶分子的生物學(xué)功能，它決定了腫瘤獨(dú)立于靶分子的難易程度。在這項(xiàng)新的研究中，這些作者沒有直接分析靶細(xì)胞丟失作為一種抵抗性機(jī)制的概率，盡管他們在體內(nèi)模型中沒有觀察到這種效應(yīng)。然而，由于與人類腫瘤治療相比，小鼠實(shí)驗(yàn)的時間跨度有限，這可能會被忽略，就像CD19的情況一樣。以前的大量研證實(shí)了CD66c、CD318和TSPAN8對癌癥的侵襲性和傳播起著關(guān)鍵作用。然而，它們是否對腫瘤細(xì)胞的生存至關(guān)重要，特別是對PDAC而言，仍然不清楚。這進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了多靶標(biāo)可用性的必要性，允許聯(lián)合治療，從而通過增加對腫瘤細(xì)胞的選擇性壓力來減少靶標(biāo)陰性疾病復(fù)發(fā)（target-negative relapse）的風(fēng)險。

對CAR-T細(xì)胞的體外靶標(biāo)特異性激活和對CD66c XS CAR進(jìn)行體內(nèi)評價，

總之，這項(xiàng)研究將基于經(jīng)驗(yàn)的抗體流式細(xì)胞儀篩選與循環(huán)免疫熒光成像平臺相結(jié)合，并對腫瘤外表達(dá)進(jìn)行了全面的生物信息學(xué)和實(shí)驗(yàn)評估，以確定PDAC特異性細(xì)胞表面標(biāo)志物。這些作者確定了四個候選靶標(biāo)，即CLA、CD66c、CD318和TSPAN8，以便通過CAR-T細(xì)胞對PDAC進(jìn)行可能的細(xì)胞免疫治療。CD66c特異性CAR、CD318特異性CAR和TSPAN8特異性CAR在體外和體內(nèi)都顯示出功能，其中CD318是最有利于臨床轉(zhuǎn)化的候選靶標(biāo)