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上海慧穎生物科技有限公司

ISK細胞形態,ISK細胞培養,ISK細胞鑒定

時間:2016-6-2閱讀:2312

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封閉

在轉膜之后,也就是抗體孵育之前,需要對膜進行封閉。封閉是為了使抗體僅僅只能跟特異的蛋白質結合而不是和膜結合。常用的封閉液有BSA,脫脂奶粉,血清等,一般用的是脫脂奶粉。脫脂奶粉有些特殊情況是不適用的 ,脫脂奶粉不能與生物素化或伴刀豆蛋白標記的抗體一起使用;不能用于磷酸化抗體對蛋白磷酸化的檢測;不能用于堿性磷酸酶(AP)顯示方法。

抗體孵育——WB真正的難點:抗體的使用是一種藝術,一種抗體一個脾氣。

對WB結果有決定性影響的因素是抗體的效價和如果正確使用手中的抗體。 無論你如何提高自己的轉膜技術,和低效之間往往只有數倍的差異, 而抗體的效價可以差數千倍以上;同樣,正確使用抗體可以保證抗體效價 不被過分的拮抗,謀求特異性和非特異性背景之間差異的zui大化。

一抗:*抗體能和非抗體性抗原特異性結合的蛋白,包括單克隆抗體和多克隆抗體;二抗:第二抗體能和一抗結合,即抗體的抗體,其主要作用是檢測抗體的存在,放大一抗的信號。一般二抗都會偶聯可以檢測的標記(如熒光、放射性、化學發光或顯色基團),用來檢測一抗;如果一抗本身偶聯有這些標記,則不需要二抗,就是所謂的直接WB。

那么如何正確的來選擇二抗呢?*根據一抗的種屬來源選擇二抗;第二根據一抗的類型選擇二抗,根據單體數量和重鏈分類,將抗體分為IgA,IgD,IgE,IgG,IgM五類。其中又可分為幾個亞型:IgA1-2,IgG1a,2a,2b,3,IgM1-2。

顯色

酶促反應可以搭配不同的底物從而實現不同的顯色方法:化學發光Chemiluminescent 和底物顯色Colormetirc/Chromogen,前者靈敏度很高——隨著各大廠家努力開發研制靈敏度更高的發光底物,化學發光法的靈敏度已經達到pg別,甚至還有 Femto級別的,靈敏度超過了同位素;而后者由于直接顯色而操作簡便且成本低。zui為大家熟悉當數辣根過氧化物酶HRP(Horseradish Peroxidase,屬于過氧化物酶POD類)和堿性磷酸酶AP(Alkaline Phosphatase),此外還有比較少見的葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase)、β半乳糖苷酶 β-Galactosidase 。

常見問題分析:

1.曝光后背景過高且不均勻

封閉不充分:延長封閉時間,更換合適的封閉劑;一抗濃度過高:增加一抗稀釋倍數;抗體孵育溫度過高:4℃孵育;二抗非特異性結合或與封閉劑交叉反應:設置二抗對照(不加一抗),降低二抗濃度。

洗膜不充分:增加洗膜次數

2.沒有陽性條帶或很弱

一抗、二抗不匹配:訂購試劑時認真選取一抗與組織種屬,一抗與二抗或底物與酶系統之間相匹配的抗體及底物,可通過設置內參驗證二級系統的有效性; 更換更好的抗體;一抗,二抗濃度低:增加抗體濃度,延長孵育時間封閉劑與一抗有交叉反應:封閉時使用溫和的去污劑,更換封閉劑樣本中無靶蛋白或靶蛋白含量過少,設置陽性對照,如果陽性對照有結果,但標本沒有則可能是標本中不含靶蛋白或是靶蛋白含量太低,后者可增加樣本上樣量;轉膜不充分還洗膜過度:使用麗春紅S檢測轉膜效果,PVDF膜需浸透,正確的轉膜操作,勿過度洗膜;曝光時間過短:延長曝光時間,更換更靈敏的發光液

3.背景有白色/黑色斑

轉膜時有氣泡或抗體分布不均:盡量除去氣泡,抗體孵育時保持搖動;封閉劑溶解不充分有顆粒狀

ISK細胞形態,ISK細胞培養,ISK細胞鑒定運輸:凍存的細胞干冰運輸,復蘇的細胞冰袋運輸。冬季我們會選擇全血清包被細胞運輸,運輸途中細胞處于休眠狀態,避免天氣過冷導致的細胞死亡。

ISK細胞形態,ISK細胞培養,ISK細胞鑒定在運輸、轉移過程中,請勿打開自封袋;拿放細胞時請持瓶體,切勿在非無菌環境中碰觸、擰動瓶口封口膜位置

進入生物安全柜前,打開自封袋拿出培養瓶,噴上酒精放進操作臺(不建議使用酒精棉球擦拭),撕開封口膜后,用酒精燈外焰對瓶口燒灼一圈(3秒左右)

細胞凍存如下:

1.細胞:選對數生長期細胞,收集細胞24小時前換液一次。

2.計數:按常規方法把細胞制成細胞懸液,計數,令細胞密度達5×106/ml,離心去上清,吸入離心管中。

3.凍存液:先用培養液9分+DMSO 1分(或甘油)配成10%的DMSO凍存液,按上法一滴滴加入離心管中,然后用吸管輕輕吹打令細胞重懸。

4.分裝:分裝入無菌安剖中,每安剖加1.5毫升細胞懸液。

5.封口:用塑料安剖時擰緊瓶口即可;如用火焰封閉安剖口后,仔細檢查,定要封嚴,必要時可浸入藍色液中觀察,為安全起見,把安剖縫入紗布小袋中,以防液氮浸入后,融解時因受熱發生爆炸傷人;紗袋一端系以線繩,末端扎有小牌,注明:細胞名稱,凍存日期,以便日后查找。

豎立培養瓶,擰開瓶蓋(如是貼壁細胞,請用真空泵或吸管移除原配培養基,切勿讓瓶口處的液體回流進瓶內)

更換為含10%-20%血清的*培養基,嚴格按照無菌操作要求繼續培養。

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