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液相色譜分析條件的選擇
閱讀：1331 發布時間：2010-9-19
在液相色譜分析過程中，我們經常遇到的問題主要有二種，一種與液相色譜儀器本身因素有關，如液相色譜的閥門、混合器、檢測器的光源以及其它的一些硬件設備。出現這類問題后，如果能找出問題根源，解決起來一般很簡單，而且這類問題可以通過對儀器的精心維護來避免;而另一類問題則是分析方法本身造成的問題，如出現色譜峰形狀不好、峰與峰之間不能分開、基線飄移等等。不幸的是，如果出現這類問題，看起來似乎很明顯，但是要找出原因并解決這類問題卻非常困難。為了減少出現這一類型的問題，就必須在分析之前，仔細研究并選擇一個好的分析方法，有了一個好的分析方法，就很容易獲得理想的分離效果，而且在出現問題是也很便于找出原因。要選擇一個好的分析方法，就必須對液相色譜分析的一些基本原則要有一個很深的了解。下面是我們實驗室對色譜分析人員進行技能培訓的一些基本知識。
一：分析方法選擇的基本原則
假如你想做一頓豐盛的晚餐，首先必須看一下食譜，然后檢查一下你所需的東西是否齊全，如果少了配料還必須去商店購買，這樣你才可能做出一頓可口的晚餐。同樣進行液相色譜分析時，也必須按照一定的程序進行，首先你必須要有專門的儀器和試劑，然后有目的地選擇分析方法，這樣你才可能得到好的分析結果，避免走一些彎路。
假如你想做一頓豐盛的晚餐，首先必須看一下食譜，然后檢查一下你所需的東西是否齊全，如果少了配料還必須去商店購買，這樣你才可能做出一頓可口的晚餐。同樣進行液相色譜分析時，也必須按照一定的程序進行，首先你必須要有專門的儀器和試劑，然后有目的地選擇分析方法，這樣你才可能得到好的分析結果，避免走一些彎路。
二：柱子的選擇
在液相色譜分析方法中zui重要的就是色譜柱的選擇，色譜分析人員面對幾百種色譜柱，你從何入手呢?我采取的方法就是訂閱 LCGC亞太版中Ron Majors 的“色譜柱觀察”這一專欄，自1984（1）年以來，Ron Majors在這一專欄中介紹許多新柱子、色譜柱新技術、色譜柱使用方法等方面的信息。
現在大部分液相色譜分析都是使用反相色譜柱，其中以C18 和C8柱zui為流行。然而色譜分析并不是流行歌曲，這兩種色譜柱之所以運用廣泛是因為在大多數情況下，使用這兩種柱子都能獲得理想的分離效果。盡管一些樣品的分離并不是這兩種柱子（如表一所示），但 C18和C8經常是的固定相，C18和C8柱兩者之間并無明顯的差別，但在我們實驗室中以常使用的是C8柱。
色譜分析人員遇到的多數樣品需要利用反相色譜柱進行分析，但一些樣品可能需要其它的分析技術才能成功地分離，這些樣品及分離方法在表一中作了簡要的敘述，在以后的章節中將進一步闡述。
在液相色譜分析方法中zui重要的就是色譜柱的選擇，色譜分析人員面對幾百種色譜柱，你從何入手呢?我采取的方法就是訂閱 LCGC亞太版中Ron Majors 的“色譜柱觀察”這一專欄，自1984（1）年以來，Ron Majors在這一專欄中介紹許多新柱子、色譜柱新技術、色譜柱使用方法等方面的信息。
現在大部分液相色譜分析都是使用反相色譜柱，其中以C18 和C8柱zui為流行。然而色譜分析并不是流行歌曲，這兩種色譜柱之所以運用廣泛是因為在大多數情況下，使用這兩種柱子都能獲得理想的分離效果。盡管一些樣品的分離并不是這兩種柱子（如表一所示），但 C18和C8經常是的固定相，C18和C8柱兩者之間并無明顯的差別，但在我們實驗室中以常使用的是C8柱。
色譜分析人員遇到的多數樣品需要利用反相色譜柱進行分析，但一些樣品可能需要其它的分析技術才能成功地分離，這些樣品及分離方法在表一中作了簡要的敘述，在以后的章節中將進一步闡述。
表一：樣品及分析方法
樣品的特性分析方法及色譜柱
大分子量色譜柱、離子交換柱、 size-excusion色譜柱
手性異構體手性色譜柱
其它異構體（位置、立方體） 正相色譜柱、沒有改性的二氧化硅柱
無機鹽混合物離子色譜分析
碳水化合物（糖類） 反相氨基柱、離子交換法
在過去的15年中，高純度、低金屬雜質含量的硅膠基質色譜柱是zui為實用的色譜柱之一。但傳統色譜分析用的硅膠顆粒具有差異性及酸性表面，固定在柱子表面后，導致出現拖尾峰，而且柱與柱之間的重現性較差（2.3）。zui近硅膠基質中出現一種新的產品，這種硅膠具有Metal-free 特性，因此柱子性能更穩定，重現性也更好，分離后峰的形狀也很不錯。這種改性后的硅膠稱為B型硅膠。由于具有上述優點，大多數色譜制造商都用不同的名稱來表明它們與傳統的產品之間的不同，如Intertsil （日本）、 BDS（USA）、YMC--Base（USA）等等。大多數色譜柱制造商都生產以B型硅膠為基質的色譜柱，因此你可以選擇你所喜歡的供應商提供的產品。由于這種產品具有上述特性，建議使用A型硅膠柱的改為使用B硅膠柱。
樣品的特性分析方法及色譜柱
大分子量色譜柱、離子交換柱、 size-excusion色譜柱
手性異構體手性色譜柱
其它異構體（位置、立方體） 正相色譜柱、沒有改性的二氧化硅柱
無機鹽混合物離子色譜分析
碳水化合物（糖類） 反相氨基柱、離子交換法
在過去的15年中，高純度、低金屬雜質含量的硅膠基質色譜柱是zui為實用的色譜柱之一。但傳統色譜分析用的硅膠顆粒具有差異性及酸性表面，固定在柱子表面后，導致出現拖尾峰，而且柱與柱之間的重現性較差（2.3）。zui近硅膠基質中出現一種新的產品，這種硅膠具有Metal-free 特性，因此柱子性能更穩定，重現性也更好，分離后峰的形狀也很不錯。這種改性后的硅膠稱為B型硅膠。由于具有上述優點，大多數色譜制造商都用不同的名稱來表明它們與傳統的產品之間的不同，如Intertsil （日本）、 BDS（USA）、YMC--Base（USA）等等。大多數色譜柱制造商都生產以B型硅膠為基質的色譜柱，因此你可以選擇你所喜歡的供應商提供的產品。由于這種產品具有上述特性，建議使用A型硅膠柱的改為使用B硅膠柱。
三：柱子尺寸規格的選擇
液相色譜分析時柱子選擇的另一個因素就是柱子大小、及填充顆粒的直徑（dp）的選擇。zui常用顆粒直徑為5μm，但顆粒的直徑（dp）為3.0及3.5μm的也適合分析使用，但大多數色譜工作者都喜歡使用顆粒直徑為5μm的色譜柱，因為這種色譜柱具有很長的使用歷吏。顆粒的dp小意味著可以獲得較高的理論塔板數，但所需的柱壓增大，而且dp 為3.0μm的色譜柱易堵塞，所以一些色譜制造商又生產出dp 為3.5μm的色譜柱。
在我們實驗室中經常使用的是150mm×4.6mm，dp為5μm的色譜柱。另一種可以選擇的色譜柱為75mm×4.6mm，dp為3.5μm的柱子，這種柱子的分離效果與前一種色譜柱分離效果相似，但使用時間減小一半。這兩種柱子還有一個優點就是在合理的壓力下（<2000psi ），流速可以設定在1.5--2.0ml/min之間，而流速高意味著可以縮短分析時間。
有些分析者建議使用30 or50mm長的柱子作為前處理柱，但這種柱子不能提供足夠的塔板數。另一種意見是使用窄孔柱（2mmid）或微孔柱（≤1mmid），這兩種柱子所需的溶劑少，但是這兩種柱子所需的某些儀器與正常使用的色譜儀有些不同，而且正處在一個研究階段，建議等這兩種色譜柱研究成熟之后再使用。
150mm×4.6mm，dp為5μm的色譜柱zui為常用，75mm×4.6mm，dp為3.5μm的色譜柱也中較常見，在一般情況下流速可設定為1.5ml/min。
液相色譜分析時柱子選擇的另一個因素就是柱子大小、及填充顆粒的直徑（dp）的選擇。zui常用顆粒直徑為5μm，但顆粒的直徑（dp）為3.0及3.5μm的也適合分析使用，但大多數色譜工作者都喜歡使用顆粒直徑為5μm的色譜柱，因為這種色譜柱具有很長的使用歷吏。顆粒的dp小意味著可以獲得較高的理論塔板數，但所需的柱壓增大，而且dp 為3.0μm的色譜柱易堵塞，所以一些色譜制造商又生產出dp 為3.5μm的色譜柱。
在我們實驗室中經常使用的是150mm×4.6mm，dp為5μm的色譜柱。另一種可以選擇的色譜柱為75mm×4.6mm，dp為3.5μm的柱子，這種柱子的分離效果與前一種色譜柱分離效果相似，但使用時間減小一半。這兩種柱子還有一個優點就是在合理的壓力下（<2000psi ），流速可以設定在1.5--2.0ml/min之間，而流速高意味著可以縮短分析時間。
有些分析者建議使用30 or50mm長的柱子作為前處理柱，但這種柱子不能提供足夠的塔板數。另一種意見是使用窄孔柱（2mmid）或微孔柱（≤1mmid），這兩種柱子所需的溶劑少，但是這兩種柱子所需的某些儀器與正常使用的色譜儀有些不同，而且正處在一個研究階段，建議等這兩種色譜柱研究成熟之后再使用。
150mm×4.6mm，dp為5μm的色譜柱zui為常用，75mm×4.6mm，dp為3.5μm的色譜柱也中較常見，在一般情況下流速可設定為1.5ml/min。
四：有機相的選擇
獲得成功分離的另一個重要因素就是流動相有機溶劑的選擇，如果使用反相色譜柱可以有三種有機溶劑可以選擇，甲醇、乙腈和四氫呋喃。每一種溶劑都有其*的優點，但色譜分析人員很少能預見哪一種溶劑更合適，所以具體選擇哪一種溶劑你必須充分考慮同行的意見。
在我的實驗室中多數工作分析藥物中的成份，其中有些樣品的紫外吸收很弱，所以分析時紫外檢測器的波長為220nm甚至更低，但是四氫呋喃的紫外吸收比較強，所以在波長低于240nm時，就不能選擇這種溶劑。盡管低濃度的甲醇在較低的波長下也可使用，但是在低于220nm時，甲醇的濃度不易控制。選擇何種溶劑還必須考慮其與樣品及空氣之間不發生作用，而四氫呋喃易分解，形成過氧化物，所以使用這種溶劑時須格外小心。一些研究人員發現，在四氫呋喃中加入水可以解決這個問題（4），但它與色譜柱平衡所需的時間比甲醇、乙腈長，而且其不愉快的氣味也是一個不利因素。與四氫呋喃相比，甲醇和乙腈的zui大優點是在柱壓較低的條件下，流速可控制在1-2ml/min之間。
考慮到理想溶劑的特點，如粘度低、紫外吸收弱、與樣品不相互作用，而且使用方便，所以的有機溶劑應是乙腈，當然利用甲醇作為有機溶劑的也較為常見。
獲得成功分離的另一個重要因素就是流動相有機溶劑的選擇，如果使用反相色譜柱可以有三種有機溶劑可以選擇，甲醇、乙腈和四氫呋喃。每一種溶劑都有其*的優點，但色譜分析人員很少能預見哪一種溶劑更合適，所以具體選擇哪一種溶劑你必須充分考慮同行的意見。
在我的實驗室中多數工作分析藥物中的成份，其中有些樣品的紫外吸收很弱，所以分析時紫外檢測器的波長為220nm甚至更低，但是四氫呋喃的紫外吸收比較強，所以在波長低于240nm時，就不能選擇這種溶劑。盡管低濃度的甲醇在較低的波長下也可使用，但是在低于220nm時，甲醇的濃度不易控制。選擇何種溶劑還必須考慮其與樣品及空氣之間不發生作用，而四氫呋喃易分解，形成過氧化物，所以使用這種溶劑時須格外小心。一些研究人員發現，在四氫呋喃中加入水可以解決這個問題（4），但它與色譜柱平衡所需的時間比甲醇、乙腈長，而且其不愉快的氣味也是一個不利因素。與四氫呋喃相比，甲醇和乙腈的zui大優點是在柱壓較低的條件下，流速可控制在1-2ml/min之間。
考慮到理想溶劑的特點，如粘度低、紫外吸收弱、與樣品不相互作用，而且使用方便，所以的有機溶劑應是乙腈，當然利用甲醇作為有機溶劑的也較為常見。
五：水相的選擇
假如樣品為一般化合物，可以用水作為水相，然而離子化合物在藥物分析時普遍存在，而這類化合物需要控制PH值才能得到很好的分離。如流動相的PH值必須高于或低于樣品的PKA1.5個單位。在分析有機酸時，當PH值低于3時，色譜柱一般還比較穩定，然而當PH值高于8時，就需要緩沖液，因為此PH值已經超出了二氧化硅的有效使用范圍。寬PH值的二氧化硅柱也比較常見，但是對高PH值物質的分離，很少有這方面的報道。所以建議使用緩沖液來減少二氧化硅的流失。
考慮到樣品的特性及柱子的穩定，建議在分析PH值較高的物質時應使用緩沖液，2.5mM的磷酸鹽緩沖液 （PH=2.5）是非常合適的水相。如果在分析方法中使用了分光儀，那么就必須選擇易揮發的緩沖液，盡管不如真正的緩沖液有用，但0.1% Trifluoroacetic酸和乙酸能夠滿足PH值的控制要求。
假如樣品為一般化合物，可以用水作為水相，然而離子化合物在藥物分析時普遍存在，而這類化合物需要控制PH值才能得到很好的分離。如流動相的PH值必須高于或低于樣品的PKA1.5個單位。在分析有機酸時，當PH值低于3時，色譜柱一般還比較穩定，然而當PH值高于8時，就需要緩沖液，因為此PH值已經超出了二氧化硅的有效使用范圍。寬PH值的二氧化硅柱也比較常見，但是對高PH值物質的分離，很少有這方面的報道。所以建議使用緩沖液來減少二氧化硅的流失。
考慮到樣品的特性及柱子的穩定，建議在分析PH值較高的物質時應使用緩沖液，2.5mM的磷酸鹽緩沖液 （PH=2.5）是非常合適的水相。如果在分析方法中使用了分光儀，那么就必須選擇易揮發的緩沖液，盡管不如真正的緩沖液有用，但0.1% Trifluoroacetic酸和乙酸能夠滿足PH值的控制要求。
六：其它的因素
在你選擇液相色譜的分析方法時，必須考慮到其它的一些因素，比如溫度。因為溫度變化1度，保留時間將變化1-3%，所以溫度控制十分重要，溫度的變化還影響色譜柱的選擇性，這會使你更積極地投入到溫度選擇中去。在分析時柱溫一般比室溫高一點（如35℃），因為此溫易控制，而且在低壓下有利于降低溶劑的粘度，從而降低柱壓。有時你需要利用其它的一些方法，如在流動相中加入部分特殊的物質，不過我建議在你實在必須時才用這種方法，記住KISS原則（Keep it simple ，stupid），不要使你的流動相過分復雜!
在你選擇液相色譜的分析方法時，必須考慮到其它的一些因素，比如溫度。因為溫度變化1度，保留時間將變化1-3%，所以溫度控制十分重要，溫度的變化還影響色譜柱的選擇性，這會使你更積極地投入到溫度選擇中去。在分析時柱溫一般比室溫高一點（如35℃），因為此溫易控制，而且在低壓下有利于降低溶劑的粘度，從而降低柱壓。有時你需要利用其它的一些方法，如在流動相中加入部分特殊的物質，不過我建議在你實在必須時才用這種方法，記住KISS原則（Keep it simple ，stupid），不要使你的流動相過分復雜!
七：總結
在液相色譜分析時條件的選擇非常重要，而且流動相是你常年與之打交道的，所以你必須慎重選擇。一些較為常見的分析條件見如表二所示。
表二
分析條件內容
色譜柱大小 150mm×4.6mm，
顆粒 dp為5μm
固定相 C18或C8
流動相溶劑A、B 水、乙腈B% 可變
緩沖液 2.5mM的磷酸鹽緩沖液
流速 1--2ml/min
溫度 35℃
在液相色譜分析時條件的選擇非常重要，而且流動相是你常年與之打交道的，所以你必須慎重選擇。一些較為常見的分析條件見如表二所示。
表二
分析條件內容
色譜柱大小 150mm×4.6mm，
顆粒 dp為5μm
固定相 C18或C8
流動相溶劑A、B 水、乙腈B% 可變
緩沖液 2.5mM的磷酸鹽緩沖液
流速 1--2ml/min
溫度 35℃