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逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)實驗過程詳解
閱讀：47 發(fā)布時間：2024-11-18逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) （Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）可以：(1）分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；（2）獲取目的基因；（3）合成cDNA探針；（4）構(gòu)建RNA高效轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。
實驗方法原理:
逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取組織或細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達。
實驗過程:
一、總RNA的提取
總RNA提取可以：（1）獲得高純度、高質(zhì)量的總RNA；（2）可以滿足生物學(xué)下游實驗Northern Blot、核酸酶保護實驗、RT-PCR、qRT-PCR 和陣列分析所需。
二、cDNA第一鏈的合成
目前試劑公司有多種cDNA第一鏈試劑盒出售，其原理基本相同，但操作步驟不一。現(xiàn)以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 試劑盒為例。
1． 在0.5 ml微量離心管中，加入總RNA 1-5 μg，補充適量的DEPC H2O使總體積達11 μl。在管中加10 μM Oligo（dT）12-18 1 μl，輕輕混勻、離心；
2．70℃加熱10min，立即將微量離心管插入冰浴中至少1min；
3． 取0.5 ml PCR管，依次加入下列試劑：第一鏈cDNA 2 μl；上游引物（10 pM） 2 μl；下游引物（10 pM） 2 μl；dNTP(2mM) 4 μl；10×PCR buffer 5 μl；Taq 酶（2 u/μl） 1 μl。輕輕混勻，離心。42℃孵育2-5 min；
4．加入SuperscriptⅡ1 μl ，在42℃水浴中孵育50 min；
5． 于70℃加熱15 min以終止反應(yīng)；
6．將管插入冰中，加入RNase H 1 μl ，37℃孵育20 min，降解殘留的RNA。-20℃保存?zhèn)溆谩?br/>
三、PCR
1．取0.5 ml PCR管，依次加入下列試劑：第一鏈cDNA 2 μl；上游引物（10 pM）2 μl；下游引物（10 pM）2 μl；dNTP(2 mM) 4 μl；10×PCR buffer 5 μl；Taq 酶（2 u/μl）1 μl；
2．加入適量的ddH2O，使總體積達50 μl。輕輕混勻，離心；
3．設(shè)定PCR程序。在適當(dāng)?shù)臏囟葏?shù)下擴增28-32個循環(huán)。為了保證實驗結(jié)果的可靠與準(zhǔn)確，可在PCR擴增目的基因時，加入一對內(nèi)參（如G3PD）的特異性引物，同時擴增內(nèi)參DNA，作為對照；
4．電泳鑒定：行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果；
5．密度掃描、結(jié)果分析：采用凝膠圖像分析系統(tǒng)，對電泳條帶進行密度掃描。
注意事項:
1．在實驗過程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在總RNA的提取過程中，注意避免mRNA的斷裂；
2． 為了防止非特異性擴增，必須設(shè)陰性對照；
3．內(nèi)參的設(shè)定：主要為了用于靶RNA的定量。常用的內(nèi)參有G3PD（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）、β-Actin（β-肌動蛋白）等。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應(yīng)體系中擴增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差；
4． PCR不能進入平臺期，出現(xiàn)平臺效應(yīng)與所擴增的目的基因的長度、序列、二級結(jié)構(gòu)以及目標(biāo)DNA起始的數(shù)量有關(guān)。故對于每一個目標(biāo)序列出現(xiàn)平臺效應(yīng)的循環(huán)數(shù)，均應(yīng)通過單獨實驗來確定；
5． 防止DNA的污染： 采用DNA酶處理RNA； 在可能的情況下，將PCR引物置于基因的不同外顯子，以消除基因和mRNA的共線性。