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由于CO2培養箱受使用環境和條件的影響較大，許多廠家在產品設計上仍保留用戶重新校準的部件，一般是在面板上設有校準和調零微調。無論哪種類型的產品，校準工作都應在箱內的溫度和濕度穩定之后進行。
1、溫度校準：
有的產品在出廠前已完成溫度校準工作，校準部件均安裝在箱內的控制板上，用戶不宜再作調整。對于面板上有校準微調的產品，可在接近培養溫度下(如37℃)，取一根精密溫度計置于箱內，待溫度穩定后觀察溫度計指示值，如與顯示值不跗，調整微調使其相附即可。
溫度的校準步驟：
①在培養箱內放置一個準確的玻璃管式水銀溫度計，以校準所設定溫度。同時，再放置一個準確的體溫計，以校準極限溫度。
②把溫度旋鈕調到所需溫度37℃。
③把極限溫度旋鈕調到最大。等待24小時，讓機器達到穩定。
④如果溫度還沒達到37℃，再調整溫度旋鈕到37℃，然后再等待24小時，讓機器最后達到穩定。
⑤當培養箱穩定在37℃后，按逆時針方向轉動極限溫度旋鈕，直到該極限溫度旋鈕的指示燈明亮為止。
⑥再小心地把極限溫度旋鈕順時針方向轉動，直到指示燈剛好熄滅為止。
注意:機器正常運轉期間，其極限溫度指示燈應保持熄滅狀態。