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本期我們邀請(qǐng)到的是中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司高紅波老師

背景介紹：
2,4,6-三氯苯甲醚（TCA）
是霉菌代謝含有三氯苯酚等一系列含氯的化合物經(jīng)過復(fù)雜的反應(yīng)后產(chǎn)生的化學(xué)副產(chǎn)物^[1]，一般認(rèn)為高于10 ng/L超痕量TCA就會(huì)對(duì)葡萄酒的風(fēng)味和品質(zhì)產(chǎn)生影響，使葡萄酒產(chǎn)生一種類似潮濕地下室或濕報(bào)紙的霉味^[2]。TCA是非常穩(wěn)定的化合物,灌瓶后滲透到葡萄酒中的TCA比葡萄酒本身更穩(wěn)定^[3]。每年給葡萄酒工業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
由于這種污染主要是由封裝葡萄酒的軟木塞引起的，橡木塞由于其特殊的性能又很難用其他的螺旋塞等代替，因此建立一套能對(duì)葡萄酒和軟木塞中TCA進(jìn)行檢測與分析定量的既精.確又高效的方法就愈發(fā)的重要，從而對(duì)葡萄酒在生產(chǎn)和儲(chǔ)藏過程中的每一個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行有效地質(zhì)量控制，達(dá)到控制污染水平的目的。

分析方法簡介
樣品前處理技術(shù)是葡萄酒和軟木塞中TCA檢測的關(guān)鍵，目前國內(nèi)外軟木塞中TCA的方法主要是固相萃取（SPE）、固相微萃取（SPME）、離子遷移譜等^[4-10]。
 本文對(duì)固相微萃取技術(shù)測定TCA樣品前處理?xiàng)l件進(jìn)行研究,并通過方法學(xué)評(píng)價(jià)，建立了固相微萃取-GC-ECD法測定軟木塞及葡萄酒中超痕量TCA的方法，并開展了不同類型葡萄酒用軟木塞和葡萄酒中TCA含量的測定，為葡萄酒企業(yè)開展葡萄酒用軟木塞的測定提供有效途徑。

1材料與方法
1.1儀器與試劑
氣相色譜儀；
固相萃取頭：涂層厚為100 µm的聚二甲硅烷氧烷纖維頭（PDMS）。
乙醇（色譜純）；
2,4,6-三氯苯甲醚；
2,4-二氯苯甲醚（DCA）
氯化鈉（分析純）
葡萄酒樣品（廠家提供），
1.2實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1葡萄酒樣品測定

50. 取5mL葡萄酒樣品于20ml頂空瓶中，
50. 加入1.5 gNaCI，100μL 50μ/L的DCA標(biāo)準(zhǔn)液，壓蓋，進(jìn)樣。

1.2.2軟木塞處理 

50. 取10~15 個(gè)軟塞子于 500 mL試劑瓶，
50. 加入300 mL12 %乙醇水溶液，使塞子*浸沒，浸泡24 h±2 h。取 5 mL 浸泡液于 20 mL 頂空瓶中，以下步驟同1.2.1。

1.2.3 萃取及色譜條件
   固相微萃取條件：

50. 將頂空瓶置于恒溫加熱磁力攪拌器中，40℃平衡10min，
50. 將固相微萃取頭插入頂空瓶，在40℃持續(xù)攪拌下萃取30min，
50. 然后在氣相色譜進(jìn)樣口260℃解析時(shí)間：5 min。

氣相色譜條件：

50. 色譜柱：HP-5毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）或等效色譜柱；
50. 柱溫：初溫50℃，保持2 min，以9.0℃/min升到150℃，保持1 min，以20℃/min升到260℃，保持3 min；
50. 進(jìn)樣口溫度：260℃；
50. 電子捕獲檢測器溫度：330℃；
50. 載氣流量：1.0 mL/min；
50. 進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；

2 結(jié)果與討論
2.1  固相微萃取條件的優(yōu)化
2.1.1  NaCI添加量的選擇
無機(jī)鹽NaCl的添加量對(duì)TCA的萃取效果具有重要影響。在溶液中加入NaCl，溶液的粒子強(qiáng)度增加，使有機(jī)分析物的非極性相對(duì)增強(qiáng)并使其在水溶液中的溶解度下降，萃取量得到增加，同時(shí)NaCl的加入還會(huì)影響基質(zhì)粘度，降低分析物的擴(kuò)散速度，產(chǎn)生鹽的負(fù)效應(yīng)。
本實(shí)驗(yàn)選擇5mL樣品，萃取溫度40℃，對(duì)NaCl的加入量進(jìn)行優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)隨著NaCl量增加，TCA和DCA峰面積逐漸升高然后降低,當(dāng)加入1gNaCl時(shí)兩者峰面積達(dá)到大,結(jié)果見圖1 因此選擇加入1.5gNaCl。


圖1 NaCl的添加量對(duì)萃取效果的影響
2.1.2 萃取溫度的選擇
萃取溫度對(duì)萃取效果的影響具有兩面性：一方面，溫度升高有利于有機(jī)組分從液體擴(kuò)散到頂空部分
另一方面，溫度升高又會(huì)使有機(jī)組分在吸附填料與樣品中的分配系數(shù)降低，從而降低對(duì)被分析組分的吸附量。本文固定其它條件對(duì)吸附溫度進(jìn)行優(yōu)化，由圖2可見，吸附溫度升高時(shí)吸附量有所增加，當(dāng)溫度由40℃提高到50℃時(shí)峰面積有所降低，所以選擇40℃作為吸附溫度。

圖2 萃取溫度對(duì)萃取效果的影響

2.1.3 萃取時(shí)間的優(yōu)化
SPME萃取時(shí)間對(duì)待測組分的萃取效果有較大的影響，固定萃取溫度及溶液離子強(qiáng)度等其它條件不變，對(duì)不同萃取時(shí)間進(jìn)行比較。取40ppt的TCA標(biāo)準(zhǔn)溶液加入1.5g氯化鈉， 100µl 工作液(2.0ppt) 分別萃取10min 、20min 、30min 、40min(樣品平衡時(shí)間均為5min)進(jìn)行比較。由圖3可見，吸附時(shí)間加長時(shí)TCA吸附量有所增加，當(dāng)萃取時(shí)間到30min時(shí)峰面積平穩(wěn)，所以選擇30min作為萃取時(shí)間。
固相微萃取-氣相色譜法測定軟木塞及葡萄酒中超痕量2,4,6-三氯苯甲醚

圖3 萃取時(shí)間對(duì)萃取效果的影響

2.2  測定條件優(yōu)化
  采用程序升溫對(duì)TCA色譜測定條件進(jìn)行了優(yōu)化，DCA及TCA與樣品基質(zhì)的干擾組分得到良好的分離見圖1

                             圖1 TCA標(biāo)準(zhǔn)品及樣品譜圖
2.3 方法學(xué)評(píng)價(jià)
2.3.1 線性范圍及檢出限
分別配制2.0ng/L～50 ng/L 5個(gè)不同質(zhì)量濃度的TCA種標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述確定的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行測定，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以TCA峰面積與DCA峰面積之比為縱坐標(biāo)、繪制出測定曲線，線性回歸方程y=18.947x，相關(guān)系數(shù)R² =0.9989,信噪比大于10時(shí),定量下限為0.60 ng/L。
2.3.2回收率的測定
在軟木塞浸泡液及葡萄酒中加入不同濃度的TCA標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照實(shí)驗(yàn)方法測定計(jì)算方法回收率，結(jié)果如表2，TCA的回收率在80.0%～113.75%之間，說明說明該法具有很好可靠性和準(zhǔn).確性。
表1 方法的加標(biāo)回收率

2.3.3重復(fù)性測定
   取同一樣品6份按照實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測定TCA含量，計(jì)算方法相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表2，方法的重復(fù)性小于10%，說明此方法可靠，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確。
表2  方法重復(fù)性測定

2.4 樣品中TCA的測定
按照實(shí)驗(yàn)方法對(duì)本次測試3種個(gè)不同類型的橡木塞及7個(gè)葡萄酒樣品，標(biāo)品及樣品的譜圖樣品結(jié)果如下表3：
表3   軟木塞及葡萄酒中TCA檢測結(jié)果 (ng/L)

注：ND表示未檢測出
這3種木塞類型代表了國內(nèi)葡萄酒高中低當(dāng)葡萄酒的封裝材料，由上表可以看出測試的原木塞沒有檢測出TCA，生產(chǎn)原木的原料控制的很好，原木經(jīng)過消毒加工過程中也沒有受到很多污染。1+1貼片塞檢出了TCA，與 遭受污染跟使用的粘合劑，加工方式，以及碎木屑的種類以碎木屑的衛(wèi)生狀況有關(guān)；檢測的7種葡萄酒中有4種檢測出TCA，說明我國葡萄酒存在一定量的TCA污染。

3 結(jié) 論
建立了固相微萃取-氣相色譜法測定軟木塞及葡萄酒中超痕量2,4,6-三氯苯甲醚（TCA）的分析方法。對(duì)萃取溫度、鹽濃度及萃取時(shí)間等條件進(jìn)行了優(yōu)化。確定.佳條件：5ml樣品，加入1.5g 氯化鈉，萃取溫度為40℃，40℃平衡10min，萃取時(shí)間30min。待測組分經(jīng)過萃取富集后，氣相色譜-電子捕獲檢測器檢測，內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量。該方法在2.0～50.0ng/L范圍內(nèi)線性良好，定量限為0.6ng/L，回收率在 80.0 %113.75 %之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）小于10.0%，滿足葡萄酒及軟木塞中超痕量TCA測定的需要。

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