增加PCR的特異性：

1. primers design
這是最重要的一步。理想的，只同目的序列兩側的單一序列而非其它序列退火的primer要符合下面的一些條件
a. 足夠長,18-24bp,以保證特異性.當然不是說越長越好,太長的primer同樣會降低特異性,并且降低產量
b. GC% 40%~60%
c. 5'端和中間序列要多GC,以增加穩定性
d. 避免3'端GC rich, 最后3個BASE不要有GC,或者最后5個有3個不要是GC (有人說：3' 端最好是 GC/CG/CC/GG。)
e. 避免3'端的互補, 否則容易造成DIMER
f. 避免3'端的錯配
g. 避免內部形成二級結構
h. 附加序列(RT site, Promoter sequence)加到5'端, 在算Tm值時不算,但在檢測互補和二級結構是要加上它們
i. 使用兼并primer時, 要參考密碼子使用表,注意生物的偏好性,不要在3'端使用兼并primer,并使用較高的primer濃度(1uM-3uM)
j. 最好學會使用一種design software. PP5,Oligo6,DNAstar, Vector NTI, Online design et al.
* primer的另一個重要參數是熔解溫度（Tm）。這是當50％的primer和互補序列表現為雙鏈DNA分子時的溫度.Tm對于設定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態下，退火溫度足夠低，以保證primer同目的序列有效退火，同時還要足夠高，以減少非特異性結合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設定比primer的 Tm低5℃。
設定Tm有幾種公式。有的是來源于高鹽溶液中的雜交，適用于小于18堿基的primer。
有的是根據GC含量估算Tm。確定primerTm最可信的方法是近鄰分析法。這種方法從序列一級結構和相鄰堿基的特性預測primer的雜交穩定性。大部分計算器程序使用近鄰分析法。
根據所使用的公式及primer序列的不同，Tm會差異很大。因為大部分公式提供一個估算的Tm值，所有退火溫度只是一個起始點。可以通過分析幾個逐步提高退火溫度的反應以提高特異性。開始低于估算的Tm5℃，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少primer二聚體和非特異性產物的形成。
為獲得最佳結果，兩個primer應具有近似的Tm值。primer對的Tm差異如果超過5℃，就會primer在循環中使用較低的退火溫度而表現出明顯的錯誤起始。如果兩個primerTm不同，將退火溫度設定為比的Tm低5℃
或者為了提高特異性，可以在根據較高Tm設計的退火溫度*行5個循環，然后在根據較低Tm設計的退火溫度進行剩余的循環。這使得在較為嚴緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。

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PCR實用技巧

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