理論基礎(chǔ)
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)作為一種革命性的方法在生物學(xué)研究的歷史中占據(jù)了重要的地位。以此為基礎(chǔ)發(fā)展出包括real-time PCR在內(nèi)的多項(xiàng)應(yīng)用技術(shù)。自誕生后real-time PCR技術(shù)持續(xù)發(fā)展，從簡(jiǎn)單的增擴(kuò)到整個(gè)PCR過(guò)程，real-time PCR表現(xiàn)出比PCR更敏感、更明確的定量分析特性和對(duì)識(shí)別等位基因的能力。
不少人以為real-time就是意味著可以在顯示器上看到每個(gè)循環(huán)增擴(kuò)曲線(xiàn)的增長(zhǎng)。事實(shí)并非如此，早期的軟件不能在運(yùn)行期間提供可視化的增擴(kuò)曲線(xiàn)。主要是因?yàn)镾DS軟件采用整個(gè)平臺(tái)最終的數(shù)據(jù)執(zhí)行數(shù)據(jù)分析工作，而不是分析每個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)循環(huán)。對(duì)某些設(shè)備來(lái)說(shuō)，必須向分析軟件提供實(shí)時(shí)的最終的數(shù)據(jù)，有些設(shè)備則不需要。前一種設(shè)備允許軟件實(shí)時(shí)跟蹤每個(gè)加樣口的增擴(kuò)曲線(xiàn)，同時(shí)顯示在電腦屏幕上。Real-time PCR其實(shí)是一種real-time設(shè)備。
RNA定量分析依靠逆轉(zhuǎn)錄酶制作cDNA（complementary DNA）。常見(jiàn)的逆轉(zhuǎn)錄酶有2種，AMV和MMLV。AMV是一種鳥(niǎo)類(lèi)myeloblastosis病毒的二聚體蛋白質(zhì)，MMLV來(lái)自于鼠科leukemia病毒的monomeric蛋白。2種酶都有RNase把RNA變性為RNA-DNA雜交體的活性，比較而言AMV有更高的RNase H活性。RNase H活性和依賴(lài)于RNA的DNA聚合酶活性能被mutagenesis區(qū)分開(kāi)來(lái)。更重要的是每個(gè)AMV能把較多的分子聚攏在一起，推動(dòng)增擴(kuò)反應(yīng)的進(jìn)行。原生的AMV有高于MMLV的適用溫度，42?C對(duì)37?C。修改后的變種可以有更高的溫度極限，分別是AMV58?C，MMLV55?C。
按照以上的描述，大家可能認(rèn)為改造后的AMV是適宜從RNA制作cDNA的酶。然而，在實(shí)際使用中經(jīng)改造的MMLV工作的較好。其中的原因目前仍不明，猜測(cè)高溫破壞了2種酶的聚合酶活性，但殘留的DNA綁定活性對(duì)Taq polymerase形成物理障礙。二聚體構(gòu)象和較高的溫度極限也許使得AMV表現(xiàn)不佳。出于這個(gè)原因應(yīng)在實(shí)驗(yàn)中盡可能少的使用逆轉(zhuǎn)錄酶。需要強(qiáng)調(diào)的是即使沒(méi)有引物cDNA仍然能被逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)制造出來(lái)，RNA模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)可能自我引發(fā)反應(yīng)。有3種方法可以準(zhǔn)備逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：oligo-dT，random primers or assay-specific primers。其中oligo-dT的使用較廣泛，它使用mRNAs作為模板。但是不是所有mRNA都有poly-A尾，最大的問(wèn)題是oligo-dT把增擴(kuò)區(qū)域限制在了mRNA poly-A 尾的附近。當(dāng)轉(zhuǎn)錄較長(zhǎng)的片段時(shí)（<500bp）反應(yīng)開(kāi)始于3’ UTR。這樣的結(jié)果有高的忠實(shí)性，也意味著增擴(kuò)出的序列可能不會(huì)跨過(guò)一個(gè)外顯子連接。對(duì)于有些實(shí)驗(yàn)，3’ UTR富含不利于PCR實(shí)驗(yàn)的A/T堿基。因此使用自由引物制造轉(zhuǎn)錄序列放棄3’ UTR，但自由引物也同時(shí)會(huì)制造核糖體和transfer RNAs的cDNA，出現(xiàn)大量且復(fù)雜的cDNA。第三種方法是使用針對(duì)每個(gè)實(shí)驗(yàn)的引物（assay-specific primers），理論上講這種引物滿(mǎn)足轉(zhuǎn)錄目標(biāo)序列的要求，得到相應(yīng)的cDNA產(chǎn)物。
Real-time PCR反應(yīng)增擴(kuò)子的最大長(zhǎng)度大約在250 bases，從前面的討論可知assay-specific primers是大多數(shù)實(shí)驗(yàn)較佳的選擇。但是assay-specific primers有2個(gè)明顯的缺點(diǎn)，每次PCR反應(yīng)使用較多的RNA樣本，不能用于一臺(tái)儀器上同時(shí)處理幾種樣本的反應(yīng)。注意根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要合理的選擇引物，安排實(shí)驗(yàn)計(jì)劃。
現(xiàn)代PCR反應(yīng)的核心是耐熱DNA聚合酶，常用的是Thermus aquaticus也稱(chēng)Taq。野生型Taq是依賴(lài)DNA從5->3合成的，具有3->5校對(duì)功能的聚合酶，它也有5’-nuclease的活性。Real-time PCR常用變異后移除校對(duì)功能的品種。市場(chǎng)上有2種版本的Taq，修改后的Taq和熱啟動(dòng)（hot start）Taq。
現(xiàn)今市場(chǎng)上的real-time PCR設(shè)備均使用熒光劑作為信號(hào)源，熒光的強(qiáng)度隨著增擴(kuò)產(chǎn)物的增加而成比例的增長(zhǎng)。熒光劑分子吸收光線(xiàn)中狹小波長(zhǎng)的光子，能被染料吸收的光線(xiàn)叫做激發(fā)波長(zhǎng)。激發(fā)后的分子處于較高的能量狀態(tài)，持續(xù)時(shí)間很短，分子迅速衰退到原先的狀態(tài)。在這個(gè)過(guò)程中一個(gè)光子以較長(zhǎng)的波長(zhǎng)發(fā)散出來(lái)，對(duì)于每一個(gè)熒光染料都有一個(gè)優(yōu)化的激發(fā)和發(fā)散波長(zhǎng)。在狹窄的優(yōu)化波長(zhǎng)范圍內(nèi)，熒光分子能被激發(fā)或檢測(cè)到。熒光實(shí)驗(yàn)主要要求在最初和最后的10個(gè)PCR循環(huán)中信號(hào)強(qiáng)度有盡可能大的差異。熒光劑染料分子（donor或reporter）由外部的優(yōu)化波長(zhǎng)光線(xiàn)激活后，釋放出較長(zhǎng)波的光線(xiàn)去激活臨近的另一個(gè)分子（acceptor），這樣的過(guò)程稱(chēng)為三角洲。接受光線(xiàn)的分子可能會(huì)也可能不會(huì)釋放出光線(xiàn)。每一次的轉(zhuǎn)發(fā)過(guò)程都會(huì)使波長(zhǎng)有所增加，直至real-time設(shè)備能接收到。Real-time PCR的熒光劑按照功能區(qū)分有3個(gè)類(lèi)型，1. Donor發(fā)散出的熒光信號(hào)在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中被檢測(cè)到。2. Acceptor負(fù)責(zé)冷卻Donor發(fā)出的信號(hào)。3. 是參照染料，參照染料不與其他成分產(chǎn)生反應(yīng)，軟件用它校正不同加樣孔的信號(hào)。理論上講，熒光劑染料可以成為reporter。常見(jiàn)的染料有6-FAM (6-carboxy fluorescein)和YBR® Green I，前一種能被由氬離子激光制造的488 nm的波長(zhǎng)激發(fā)。6-FAM容易和寡核苷酸結(jié)合釋放出一個(gè)強(qiáng)信號(hào)。YBR® Green I與6-FAM不同，是一種自由染料。
冷卻分子可以是熒光染料也可以是其他能吸收恰當(dāng)波長(zhǎng)的光線(xiàn)能量的分子，原來(lái)和6-FAM一起使用的是TAMRA (6-carboxy-tetramethylrhodamine)。FAM在靠近TAMAR的位置上有效地吸收光子能量。除此之外，不發(fā)光的黑色染料也可用于reporter。常見(jiàn)的有DABSYL (4-(dimethylamino)azobenzene-4’-sulfonyl chloride)。參照組的熒光信號(hào)比較每個(gè)加樣孔的不同，保證每個(gè)加樣孔的信號(hào)在整體上較平穩(wěn)。設(shè)備上的不同會(huì)形成加樣孔之間數(shù)值的偏差，叫做“邊緣效應(yīng)”，要求對(duì)每個(gè)加樣孔的數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)化。但是當(dāng)邊緣效應(yīng)過(guò)大，內(nèi)側(cè)加樣孔和外側(cè)加樣孔的差距過(guò)大就不再適合參照組作為標(biāo)準(zhǔn)化的依據(jù)。常見(jiàn)的參照染料是ROX (6-carboxy-X-rhodamine)
