實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（Quantitative Real-time PCR,qPCR） 

基本原理

    qPCR 技術(shù)是在反應(yīng)體系中加入熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)，隨著 PCR 反應(yīng)的進(jìn)行，擴(kuò)增產(chǎn)物不斷積累，導(dǎo)致熒光信號(hào)不斷積累， 從而利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè) PCR 進(jìn)程。
    根據(jù) PCR 定量原理公式可推導(dǎo)出， 模板起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)與閾值循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，模板起始拷貝數(shù)越多，熒光信號(hào)達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù)越少，即 Ct 值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)樣品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光強(qiáng)度與 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量呈對(duì)應(yīng)關(guān)系， 只要對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)并得到未知樣品的 Ct 值，即可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算未知樣品的起始拷貝數(shù)。
    Ct 值指 PCR 擴(kuò)增過(guò)程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。相同模板進(jìn)行 96 次擴(kuò)增，終點(diǎn)處產(chǎn)物量不恒定，但 Ct 值卻重現(xiàn)性。

    模板 DNA 量越多，熒光達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)越少，即 Ct 值越小。Log 起始模板濃度與 Ct 呈線性關(guān)系，通過(guò)已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品 Ct 值，就可以計(jì)算出樣品中所含的模板量。

目前常用熒光標(biāo)記方法

儀器與耗材

    在普通 PCR 儀的基礎(chǔ)上增加一個(gè)熒光信號(hào)采集系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng)，就成了熒光定量 PCR 儀。其 PCR 擴(kuò)增原理和普通 PCR 儀擴(kuò)增原理相同，只是 PCR 擴(kuò)增時(shí)加入的引物是利用同位素、熒光素等進(jìn)行標(biāo)記，使用引物和熒光探針同時(shí)與模板特異性結(jié)合擴(kuò)增。擴(kuò)增的結(jié)果通過(guò)熒光信號(hào)采集系統(tǒng)實(shí)時(shí)采集信號(hào)連接輸送到計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng)得出量化的實(shí)時(shí)結(jié)果輸出，把這 PCR 儀叫做實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀 (qPCR 儀)。熒光定量 PCR 儀有單通道，雙通道，和多通道。當(dāng)只用一種熒光探針標(biāo)記的時(shí)候，選用單通道，有多熒光標(biāo)記的時(shí)候用多通道。單通道也可以檢測(cè)多熒光的標(biāo)記的目的基因表達(dá)產(chǎn)物，因?yàn)橐淮沃荒軝z測(cè)一種目的基因的擴(kuò)增量，需多次擴(kuò)增才能檢測(cè)完不同的目的基因片段的量。該儀器主要用于醫(yī)學(xué)臨床檢測(cè)，生物醫(yī)藥研發(fā)，食品行業(yè)，科研院校等機(jī)構(gòu)。