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技術(shù)文章

人晚期糖基化終末產(chǎn)物試劑盒的操作方法

閱讀:1194          發(fā)布時間:2013-7-16

實驗原理

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標本中人晚期糖基化終末產(chǎn)物 (AGEs)水平。用純化的人晚期糖基化終末產(chǎn)物 (AGEs)抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被單抗的微孔中依次加入晚期糖基化終末產(chǎn)物 (AGEs),再與HRP標記的晚期糖基化終末產(chǎn)物 (AGEs)抗體結(jié)合,形成抗體-抗原-酶標抗體復(fù)合物,經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的晚期糖基化終末產(chǎn)物 (AGEs)呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),通過標準曲線計算樣品中人晚期糖基化終末產(chǎn)物 (AGEs)濃度。

試劑盒組成

1

30倍濃縮洗滌液

20ml×1瓶

7

終止液

6ml×1瓶

2

酶標試劑

6ml×1瓶

8

標準品(960pg/ml)

0.5ml×1瓶

3

酶標包被板

12孔×8條

9

標準品稀釋液

1.5ml×1瓶

4

樣品稀釋液

6ml×1瓶

10

說明書

1份

5

顯色劑A液

6ml×1瓶

11

封板膜

2張 

6

顯色劑B液

6ml×1/瓶

12

密封袋

1個

操作方法:

1.         標準品的稀釋:本試劑盒提供原倍標準品一支,用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。

480pg/ml

5號標準品

150μl的原倍標準品加入150μl標準品稀釋液

240pg/ml

4號標準品

150μl的5號標準品加入150μl標準品稀釋液

120pg/ml

3號標準品

150μl的4號標準品加入150μl標準品稀釋液

60pg/ml

2號標準品

150μl的3號標準品加入150μl標準品稀釋液

30pg/ml

1號標準品

150μl的2號標準品加入150μl標準品稀釋液

2.         加樣:分別設(shè)空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑,其余各步操作相同)、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50μl,待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,然后再加待測樣品10μl(樣品zui終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻。

3.         溫育:用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。  

4.         配液:將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用

5.         洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30秒后棄去,如此重復(fù)5次,拍干。

6.         加酶:每孔加入酶標試劑50μl,空白孔除外。

7.         溫育:用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。  

8.         洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30秒后棄去,如此重復(fù)5次,拍干。

9.         顯色:每孔先加入顯色劑A50μl,再加入顯色劑B50μl,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色15分鐘.

10.     終止:每孔加終止液50μl,終止反應(yīng)(此時藍色立轉(zhuǎn)黃色)。

11.     測定:以空白空調(diào)零,450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。 測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。


 

 

 

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