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五月恒遠為您詳談關(guān)于免疫沉淀小技巧的那些事兒
閱讀：1903 發(fā)布時間：2018-5-22 非內(nèi)源性蛋白的相互作用， 主要是通過過表達來實現(xiàn)，通常為簡化實驗、提高 IP 效率會讓外源蛋白帶上標(biāo)簽。因此，就 tag 的使用而言存在很多小技巧。
1、 His-tagged主要用于純化蛋白。有些人喜歡用His-tagged蛋白然后進行coIP，實際上它存在潛在的隱患。因為很多蛋白會有富含histidine的domain，恰恰是因為效價非常好，所以很多內(nèi)源性的蛋白都被該抗體識別。同理，如果用Ni-NTA beads去PD（pull down） His-tagged的蛋白，*有可能 PD 那些內(nèi)源性的富含histidine domain的蛋白，造成coIP的假象，而這樣的蛋白還非常多。
2、tandem-tagged不能用于分析鈣調(diào)信號通路。tandem tag實際上從成本角度和His tag差不多，洗脫試劑價格低廉，因此可用于大規(guī)模PD之后的質(zhì)譜分析，能獲取zui全面的相互作用的信息。然而由于其中包含鈣調(diào)蛋白相互作用domain，天然會結(jié)合鈣信號相關(guān)蛋白，從而干擾或掩蓋靶蛋白與鈣信號蛋白之間的相互作用，有一定的應(yīng)用局限。
3、Myc、HA、Flag-tagged： Myc仍然會有天然的干擾，應(yīng)用略有局限；相較后兩者是人工合成專門用于tagged蛋白，因此干擾zui小、zui常用。如需進一步細致區(qū)分，a-Flag效價比a-HA略高，因此更適合IP。
4、tag的位置。將tag構(gòu)建到蛋白的 N 端還是C端，也是一個潛在的能夠影響coIP結(jié)果的因素。比如，分泌蛋白的N端通常有分泌信號肽，如果將tag構(gòu)建 到N端，則外泌時會被信號肽酶連同信號肽一起切除；所以這時必須構(gòu)建在C端。再如，多數(shù)蛋白的 C 端是疏水區(qū)，有的時候?qū)?tag 構(gòu)建在 C 端會影響蛋白原來的空間結(jié)構(gòu)，如恰好 C 端同時是相互作用的結(jié)構(gòu)域，某些時候還可能被遮 蔽，從而干擾相互作用。因此，通常構(gòu)建質(zhì)粒的時候是 N 端、C 端 tagged 同時分別構(gòu)建，以備萬一。
5、 IP 外源 tagged-A 蛋白，洗脫盡量用相應(yīng)的 多肽，一方面提高特異性，另 一方面由于洗脫條件溫和，重鏈和輕鏈脫落也會較少； 在 IP 前， 尤其對于新 Flag、 HA beads 可以用 washing buffer 或者低 pH Glycine-HCl 漂洗一下 beads， 把結(jié)合不牢的重鏈和輕鏈先洗掉。此外，F(xiàn)lag、HA-beads 通常是鼠抗，那么 IB B 蛋白的抗體應(yīng)該選用兔抗。
6、 IP 內(nèi)源性蛋白，尤其zui后涉及低 pH Glycine-HCl 洗脫或者 SDS LB 煮 beads （后者重、輕鏈更嚴重），如 B 蛋白為 60KDa 即能與 55KDa 重鏈分開時，且抗體效價許可的前提下，降低抗體投入量會顯著減弱重、輕鏈信號，從而不會使得 B 蛋白信號不致被重鏈信號吞沒； 若有條件再配合交錯抗體種屬來源， 即 IP A 蛋白的抗體為兔抗，IB B 蛋白用兔抗以外任何一種諸如鼠抗、羊抗；反之亦然。
7、即使交錯抗體的種屬，實際上當(dāng)重輕鏈脫落過多時（尤其是重鏈），在 IP 的時候它符合《WB 實戰(zhàn)指南》提到的雜蛋白過濃會非特異結(jié)合任意抗體，這在 coIP 的實驗結(jié)果分析中要格外小心。有人會說可以用未免疫的 IgG 做陰性對照，但 是偶爾會發(fā)生一些未知意外，恰好 IgG 的重鏈沒有顯影（畢竟這不是抗原抗體 特異性結(jié)合）。
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