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   Western blot(蛋白印跡)作為科研研究中實(shí)驗(yàn)其中一種方法，卻蘊(yùn)含了很多知識(shí)，可謂是小實(shí)驗(yàn)里卻有大文章。針對(duì)WB實(shí)驗(yàn)經(jīng)常遇到的一些問題，上海恒遠(yuǎn)生物技術(shù)專員總結(jié)出了應(yīng)對(duì)的一系列“5點(diǎn)”建議，希望您會(huì)喜歡！

更好的了解實(shí)驗(yàn)的5點(diǎn)注意事項(xiàng)：
1.陽性對(duì)照對(duì)裂解物用來表明實(shí)驗(yàn)室有效并且是正確的，及可證明目標(biāo)蛋白不在樣本表達(dá)。
2.跑在樣品旁邊的分子量標(biāo)準(zhǔn)能測定蛋白分子量的大小并且能監(jiān)測電泳的進(jìn)展。
3.避免手指直接接觸膜，應(yīng)使用鑷子，手指上的油脂與蛋白會(huì)封閉轉(zhuǎn)膜效率并易產(chǎn)生背景污斑。
4.確認(rèn)裁剪的膜和濾紙與凝膠尺寸相同，邊緣太大會(huì)導(dǎo)致在進(jìn)行轉(zhuǎn)膜時(shí)電流不能通過膜。
5.過度曝光的膠片不適合用于分析，因?yàn)椴荒芘卸ㄏ鄬?duì)蛋白量。

更好的解決背景高的5點(diǎn)建議：
1.稀釋抗體至合適濃度，以更高稀釋度抗體孵育更長時(shí)間。
2.抗體孵育溫度過高：  4℃孵育。
3.膜干燥：保證充分的反應(yīng)液，避免出現(xiàn)干膜現(xiàn)象。
4.封閉不充分： 延長封閉時(shí)間， 考慮更換合適的封閉劑（脫脂奶粉，BSA，血清等）。
5.未結(jié)合蛋白洗滌不充分：  增加洗滌次數(shù)。

更好的解決抗體問題的5點(diǎn)建議：
1. 一抗，二抗的比例比較重要，調(diào)整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特異的本底。 
2. 做細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，要做磷酸化某因子Western Blot，對(duì)二抗無要求，要看您實(shí)驗(yàn)條件來選擇，一般推薦用HRP標(biāo)記的二抗。
3.不同抗體，即使是同一公司的抗體，其*的抗體稀釋度也是不一樣的，需要您實(shí)驗(yàn)摸索。
4. 如果您所用的抗體識(shí)別的是蛋白上連續(xù)的幾個(gè)氨基酸，也就是線性表位，那么這種抗體可同時(shí)用于免疫組化和Western，而如果抗體識(shí)別構(gòu)象形表位，則只能用于免疫組化。一般抗體說明書上都有注明此種抗體識(shí)別的氨基酸區(qū)間。（限于單抗） 
5.抗體工作溶液一般不主張儲(chǔ)存反復(fù)使用，但是如抗體比較珍貴，可反復(fù)使用2－3次。稀釋后應(yīng)在2－3天內(nèi)使用，4度保存，避免反復(fù)凍融。

更好的解決無信號(hào)的5點(diǎn)建議：
1.二抗需和一抗宿主的物種相同（如一抗來自兔，二抗為抗兔抗體）。原因： 一抗和二抗不匹配。
2.參照說明書，設(shè)置陽性對(duì)照。原因：一抗不識(shí)別檢測物種蛋白。
3.每泳道蛋白上樣量不低于20~30μg，設(shè)置陽性對(duì)照。原因：抗原量不足。
4.使用可逆染色劑如麗春紅S檢測轉(zhuǎn)膜效果，檢測轉(zhuǎn)膜操作是否正確。PVDF膜預(yù)先浸在甲醇中。原因：轉(zhuǎn)膜不充分。
5. 使用含0.5%脫脂奶粉或更換封閉劑，減少封閉時(shí)間。原因：過度封閉使目標(biāo)蛋白不能顯色。

更好的解決多條帶現(xiàn)象的5點(diǎn)建議：
1.查閱文獻(xiàn)。原因：體內(nèi)表達(dá)的蛋白具有多種修飾形式，如乙酰化，甲基化，糖基化等。
2.在樣品緩沖液中加入足夠的蛋白酶抑制劑。原因：蛋白樣本降解（蛋白質(zhì)分子量降低）。
3.降低抗體濃度或者抗體孵育時(shí)間。原因：一抗?jié)舛冗^高，高濃度時(shí)常出現(xiàn)多蛋白條帶。
4.使用原始未傳代的細(xì)胞株，和現(xiàn)在的細(xì)胞株一起做平行對(duì)照試驗(yàn)。原因： 細(xì)胞傳代次數(shù)過多，使其蛋白表達(dá)不同。
5.降低抗體濃度，增加二抗對(duì)照（不加一抗）。原因：二抗?jié)舛冗^高，高濃度產(chǎn)生非特異結(jié)合

更好的解決其他問題的5點(diǎn)建議：
1.轉(zhuǎn)膜時(shí)膜上有氣泡或抗體在膜上分布不均。
2.背景有黑色斑點(diǎn)：抗體結(jié)合了封閉劑（過濾封閉劑）。
3.“微笑”條帶：遷移過快或電泳溫度過高，改變了pH值和遷移速度（降低遷移速度或低溫電泳）。
4.抗體量不足：確保在孵育時(shí)抗體充分浸沒膜。
5.目的條帶染色過低/過高：分離不*。

 

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