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ELISA實驗原理、步驟、ELISA問題分析

ELISA實驗原理

酶聯免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）原理

1971年Engvall和Perlmann發表了酶聯免疫吸附劑測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）用于IgG定量測定的文章，使得1966年開始用于抗原定位的酶標抗體技術發展成液體標本中微量物質的測定方法。

ELISA的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其他物質分開。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應而結合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質的量呈一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據呈色的深淺進行定性或定量分析。

由于酶的催化頻率很高，故可極大地地放大反應效果，從而使測定方法達到很高的敏感度

類型及步驟

ELISA的主要常用類型及步驟

1. 間接法測抗體

間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標記的抗抗體（二抗）以檢測與固相抗原結合的受檢抗體，故稱為間接法。操作步驟如下：

1）將特異性抗原與固相載體聯結，形成固相抗原，洗滌除去未結合的抗原及雜質。

2）加稀釋的樣本，保溫反應。樣本中的特異抗體與固相抗原結合，形成固相抗原抗體復合物。經洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體，樣本中的其他成份在洗滌過程中被洗去。

3）加酶標抗抗體。固相免疫復合物中的抗體與酶標抗抗體結合，從而間接地標記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量與樣本中受檢抗體的量正相關。

4）加底物顯色。

2. 雙抗體夾心法測抗原

雙抗體夾心法是檢測抗原zui常用的方法，操作步驟如下：

1）將特異性抗體與固相載體聯結，形成固相抗體。洗滌除去未結合的抗體及雜質。

2）加受檢樣本，保溫反應。樣本中的抗原與固相抗體結合，形成固相抗原抗體復合物。洗滌除去其他未結合物質。

3）加酶標抗體，保溫反應。固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。*洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與樣本中受檢抗原的量相關。

4）加底物顯色。

3. 雙抗原夾心法測抗體

反應原理和模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進行包被和制備酶結合物，以檢測相應的抗體。與間接法測抗體的不同之處為以酶標抗原代替酶標抗抗體

4.競爭法測抗原

小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個以上的位點，因此不能用雙抗體夾心法進行測定，可以采用競爭法模式。其原理是標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結合。標本中抗原量含量愈多，結合在固相上的酶標抗原愈少，zui后的顯色也愈淺。小分子激素、藥物等ELISA測定多用此法。

ELISA Q&A

如何選擇合適的陽性對照?

陽性對照的基本組成應該盡量與檢測樣本的組成一致，一般陽性對照多以含蛋白保護劑的緩沖液為基質，加入一定量的待檢物質。比如，以人血清為標本的測定，陽性對照多用確定的病人血清或者以復鈣人血漿為原料加入一定量標準品。

如何選擇合適的陰性對照?

陰性對照的基本組成也應該盡量與檢測樣本的組成一致，先行檢測確定其中不含待檢物質。比如，檢測人血清標本時，陰性對照應該選擇正常人血清;檢測免疫動物血清中抗體效價時，陰性對照應該選擇該動物的免疫前血清。

如何選擇*化的包被條件?

1.包被抗原的選擇

包被抗原可分為天然蛋白、重組蛋白和小分子抗原三大類。天然蛋白需經純化才能用直接吸附法包被，對于含雜質較多的抗原可以采用間接捕獲法包被（先用能夠與目的抗原反應的物質如抗體直接吸附在酶標板上，再通過特異性反應使抗原固相化）。經純化的重組蛋白一般皆可直接包板。小分子抗原比如多肽以及一些小分子有機化合物，由于分子量太小，往往難于直接吸附在酶標板上，一般都先使其與無關蛋白質如BSA等偶聯，偶聯物吸附于固相載體上。

2.包被液的選擇

一般常用的是pH9.6的碳酸鹽緩沖液，如果包被的抗原在堿性條件下不穩定的話，也可以使用pH7.2的磷酸鹽緩沖液。

3.包被溫度的選擇

通常是4-8度條件下過夜或者37度保溫2小時，我們強烈建議4-8度條件下包被，有利于蛋白活性的保持。

4.包被濃度的選擇

包被的zui適濃度隨固相載體和包被物的性質變化，一般蛋白質的包被濃度為1-5ug/ml，要明確針對特定包被抗原的zui適包被濃度需要通過實驗來確定。

包板后需要封閉嗎?應該選擇什么樣的封閉體系?

封閉是否必要，取決于ELISA的模式及具體的實驗條件。一般說來，雙抗體夾心法，只要酶標記物是高活性的，操作時洗滌*，不經封閉也可得到滿意的結果。而在間接法測定中，封閉一般是*的。

常用的封閉劑有0.05%-0.5%的BSA、10%的小牛血清、1%明膠、5%的脫脂奶粉，AbMART推薦使用5%脫脂奶粉，價廉而且封閉能力強，不過5%脫脂奶粉只適合短期內使用，不宜長期保存，所以試劑盒中較少使用。

如何正確使用酶結合物?

1.酶結合物的稀釋液

在稀釋液中常加入高濃度的無關蛋白質（例如1%BSA或5%脫脂奶粉），通過競爭抑制酶結合物在固相載體上的非特異性吸附。一般還加入能夠抑制蛋白質吸附于塑料表面的非離子型表面活性劑，如吐溫20（0.05%的濃度較為適宜）。

2.正確稀釋酶結合物

酶結合物的合適工作濃度需要通過預實驗來確定，濃度過高易導致本底偏高，濃度過低則會導致陽性信號的減弱。

酶結合物在使用前稀釋，稀釋后的酶結合物不宜長期保存，因為低濃度的酶結合物極易失活。