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免疫熒光技術常見問題及分析
閱讀：1960 發布時間：2012-7-24免疫熒光技術（Immunofluorescence technique ）又稱熒光抗體技術，是標記免疫技術中發展zui早的一種。主要是利用熒光標記的抗體與待測抗原間反應進行抗原或者半抗原物質定位的技術。本文總結了免疫熒光技術常見的問題及解析。
1、問：近期要做免疫熒光雙標，不知哪位有免疫熒光雙標技術的詳細步驟及其注意事項?
參考見解：我正在做冰凍組織切片的免疫熒光雙染。我的經驗是：
（1）選取一抗時要來源于兩種不同的動物，我用的是來源于rabbit和rat的抗體，二抗則是不同熒光信號標記的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC（綠）和donkey anti-rat-Tex-Red（紅）。
（2）我的做法是兩種一抗同時孵育，然后兩種二抗同時孵育。抗體濃度、孵育時間要仔細摸索，我感覺一抗4度孵育過夜比較好，背景比較清晰。
（3）我的陽性對照用的是陽性組織切片，陰性對照則分別是家兔和大鼠的IgG，熒光標記物對照是PBS+熒光標記物。
（4）封閉血清與二抗來源動物一致，我用的是10%的正常donkey血清。
（5）其余步驟同一般免疫熒光單標操作。
2、問：用免疫熒光方法做組織切片和培養細胞內的蛋白，兩者操作過程有哪些不同?
參考見解：只是固定方法不同。細胞固定用甲醇，切片固定用多聚甲醛，而染色方法是一樣的。
3、問：本人擬做Brdu標記神經干細胞免疫熒光，二抗為FITC標記，想請教各位大俠：
（1）抗體分裝和熒光顯微鏡觀察時是否一定要在暗室中進行?
（2）封片時是否用甘油緩沖液即可，還是用甘油和0.5mmol/L pH9.0-9.5的碳酸氫鹽緩沖液等量混合封片?
（3）免疫酶染色中的3%過氧化氫及2N鹽酸是否還需要用?
參考見解：
（1）你的二抗是用FITC標記的，為避免熒光分解，分裝及熒光顯微鏡觀察時均要避光;
（2）封片用甘油加0.5mmol/L pH9.0-9.5的碳酸氫鹽緩沖液，后者能使玻片透明;
（3）關于免疫酶染色，如果是用過氧化物酶做標記，就必須用3%H2O2以去除內源性過氧化物酶;2N鹽酸需要使用，目的是使DNA變性，讓Brdu抗體能夠充分地與已經摻入的Brdu結合。
4、問：做間接法免疫熒光染色，如何設置對照?
參考見解：是同一視野在未用熒光激發下進行對照，看是否非特異性染色。
（1）空白對照：如果你做的是石蠟切片免疫組化，這個對照必須有，目的是看自發熒光，脫蠟后直接在熒光顯微鏡下觀察。
（2）陰性對照：標本直接滴加二抗，呈陰性反應。
（3）抗原對照：標本加同種動物的未免疫血清，以PBS沖洗后，在加抗免疫球蛋白熒光抗體。因未免疫動物的血清中無特異性抗體，應呈陰性反應。
5、問：我做乳腺組織的免疫熒光染色，結果用激光共聚焦顯微鏡看很好：有陽性信號，陰性對照組也沒有熒光，但是拿到熒光顯微鏡下看，我的陰性對照組一片綠，像非特異性染色，到底哪個結果才是真實的呢?
參考見解：激光共聚焦顯微鏡的分辨率比普通熒光顯微鏡要高的多，出現上述現象首先要排除熒光顯微鏡的問題，如是不是紫外燈泡壽命到期了或者別的原因，熒光顯微鏡沒有問題，那就以共聚焦顯微鏡的結果為主。
免疫標記法可分為以下幾類：熒光免疫法、放射免疫法、酶聯免疫法（ELISA）、偶聯生物素—親和素系統的酶免法、時間分辨熒光免疫分析、解離增強鑭系元素熒光免疫分析。免疫熒光實驗的主要步驟包括細胞涂片的制備、細胞的固定及通透（或稱為透化）、細胞封閉、一抗和二抗抗體孵育及熒光檢測等。