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基因組DNA文庫構建*實驗技巧
閱讀：2317 發布時間：2012-6-21
基因組DNA文庫構建*實驗技巧
基因組DNA文庫用途十分廣泛,如用于人類及動植物基因組學研究,基因表達調控研究,分析、分離特定的基因片段等.通常情況下,基因組文庫構建的基本流程可以歸為四大步驟：分離基因組DNA、對基因組DNA作相關的處理、將基因組DNA片段連接入載體、將重組載體轉入宿主細胞.
一、分離基因組DNA（gDNA）
毫無疑問,高質量的基因組DNA對于基因組文庫構建是至關重要的.需要通過經驗來選擇合適的基因組DNA 分離方法,在分離過程中保證DNA不被過度剪切或降解,同時也要盡量保證DNA的純度.
二、處理基因組DNA
根據研究目的,研究者需要選擇合適的載體.不同的載體對基因組DNA的長度有不同的要求,必須選擇合適長度的基因組DNA來構建基因組文庫.比如,對于黏粒載體,合適的片段長度大約為40kb；對于BAC載體,合適的片段長度平均為120kb-300kb.
構建黏粒基因組DNA文庫,需要將基因組DNA用注射器抽打來隨機剪切DNA；接著用末端修復酶修復DNA,可以提高DNA連接入載體的效率；然后通過脈沖場電泳或者普通電泳來找到40kb左右的DNA片段,隨后使用膠回收試劑盒回收DNA.
構建BAC基因組DNA文庫,需要將基因組DNA用限制性內切酶（常用EcoR I、BamH I或者Hind III）來消化基因組DNA,然后通過脈沖場電泳找到合適長度的DNA片段（比如100kb-150kb）,隨后透析回收DNA.
需要注意：
（1）電泳時,要選用合適的DNA Ladder,以保證電泳后可以準確定位所需分子量的DNA.
（2）電泳以后,應盡量縮短用紫外光照射目標DNA的時間,否則會顯著降低克隆效率.
（3）回收DNA的時候,應該要避免過度離心,以防止DNA被剪切,降低文庫質量.
三、載體的選擇
目前,常用的基因組文庫載體有黏粒載體、P1噬菌體載體、PAC載體（P1人工染色體）、BAC載體（細菌人工染色體）和YAC載體（酵母人工染色體）.選用何種載體可以參考如下幾個因素：
1、目標區域的大小：
如果基因組的目標區域很小（小于50kb）,那么可以選擇黏粒載體甚至λ噬菌體載體.利用現有的商品化的黏粒載體、率的包裝混合物和合適的大腸桿菌菌株,可以方便的構建黏粒載體文庫.
如果基因組的目標區域比較大,那么P1、PAC或者BAC就比較合適了.P1操作比較困難,PAC相對簡便.BAC載體也是很好的選擇,可以利用現有的成熟產品來構建BAC文庫,比如商業化的一系列BAC載體及配套試劑盒.
如果目標區域非常大（大于250kb）,那么YAC載體就是了.不過,應用YAC載體來構建基因組文庫,操作非常繁瑣困難.
表1 各種載體的比較
載體 容量（kb）宿主 導入細胞方式
黏粒 30-45 大腸桿菌 轉導
P1 70-100 大腸桿菌 轉導
PAC 130-150 大腸桿菌 電轉
BAC 120-300 大腸桿菌 電轉
YAC 250-400 酵母 轉化
2、篩選文庫的難易程度：
黏粒載體一般使用傳統的濾膜影印雜交來篩選,但是這種方法對于構建區域圖譜及疊連群來說既費力又浪費.大容量載體文庫,如P1、PAC、BAC、YAC,以二維陣列保存,既可以用傳統的單拷貝的探針雜交法篩選,又可以用PCR進行多克隆的群體篩選.而且,使用高容量載體構建文庫,可以減少染色體步查的步驟.
3、載體拷貝數的考慮：
當把大片段DNA片段克隆到高拷貝的載體時,克隆DNA會發生重組,從而影響克隆序列的保真性和穩定性；而單拷貝載體的低產量DNA是高通量分析的瓶頸.對這一矛盾的解決方案可采用EPICENTRE公司的CopyControlTM克隆系統,CopyControlTM技術整合了單拷貝載體與多拷貝載體的優點.單拷貝載體能提高插入片段的穩定性,而且能在誘導劑的作用下,即時擴增出高拷貝數的克隆而獲得高產量的DNA.
一、分離基因組DNA（gDNA）
毫無疑問,高質量的基因組DNA對于基因組文庫構建是至關重要的.需要通過經驗來選擇合適的基因組DNA 分離方法,在分離過程中保證DNA不被過度剪切或降解,同時也要盡量保證DNA的純度.
二、處理基因組DNA
根據研究目的,研究者需要選擇合適的載體.不同的載體對基因組DNA的長度有不同的要求,必須選擇合適長度的基因組DNA來構建基因組文庫.比如,對于黏粒載體,合適的片段長度大約為40kb；對于BAC載體,合適的片段長度平均為120kb-300kb.
構建黏粒基因組DNA文庫,需要將基因組DNA用注射器抽打來隨機剪切DNA；接著用末端修復酶修復DNA,可以提高DNA連接入載體的效率；然后通過脈沖場電泳或者普通電泳來找到40kb左右的DNA片段,隨后使用膠回收試劑盒回收DNA.
構建BAC基因組DNA文庫,需要將基因組DNA用限制性內切酶（常用EcoR I、BamH I或者Hind III）來消化基因組DNA,然后通過脈沖場電泳找到合適長度的DNA片段（比如100kb-150kb）,隨后透析回收DNA.
需要注意：
（1）電泳時,要選用合適的DNA Ladder,以保證電泳后可以準確定位所需分子量的DNA.
（2）電泳以后,應盡量縮短用紫外光照射目標DNA的時間,否則會顯著降低克隆效率.
（3）回收DNA的時候,應該要避免過度離心,以防止DNA被剪切,降低文庫質量.
三、載體的選擇
目前,常用的基因組文庫載體有黏粒載體、P1噬菌體載體、PAC載體（P1人工染色體）、BAC載體（細菌人工染色體）和YAC載體（酵母人工染色體）.選用何種載體可以參考如下幾個因素：
1、目標區域的大小：
如果基因組的目標區域很小（小于50kb）,那么可以選擇黏粒載體甚至λ噬菌體載體.利用現有的商品化的黏粒載體、率的包裝混合物和合適的大腸桿菌菌株,可以方便的構建黏粒載體文庫.
如果基因組的目標區域比較大,那么P1、PAC或者BAC就比較合適了.P1操作比較困難,PAC相對簡便.BAC載體也是很好的選擇,可以利用現有的成熟產品來構建BAC文庫,比如商業化的一系列BAC載體及配套試劑盒.
如果目標區域非常大（大于250kb）,那么YAC載體就是了.不過,應用YAC載體來構建基因組文庫,操作非常繁瑣困難.
表1 各種載體的比較
載體 容量（kb）宿主 導入細胞方式
黏粒 30-45 大腸桿菌 轉導
P1 70-100 大腸桿菌 轉導
PAC 130-150 大腸桿菌 電轉
BAC 120-300 大腸桿菌 電轉
YAC 250-400 酵母 轉化
2、篩選文庫的難易程度：
黏粒載體一般使用傳統的濾膜影印雜交來篩選,但是這種方法對于構建區域圖譜及疊連群來說既費力又浪費.大容量載體文庫,如P1、PAC、BAC、YAC,以二維陣列保存,既可以用傳統的單拷貝的探針雜交法篩選,又可以用PCR進行多克隆的群體篩選.而且,使用高容量載體構建文庫,可以減少染色體步查的步驟.
3、載體拷貝數的考慮：
當把大片段DNA片段克隆到高拷貝的載體時,克隆DNA會發生重組,從而影響克隆序列的保真性和穩定性；而單拷貝載體的低產量DNA是高通量分析的瓶頸.對這一矛盾的解決方案可采用EPICENTRE公司的CopyControlTM克隆系統,CopyControlTM技術整合了單拷貝載體與多拷貝載體的優點.單拷貝載體能提高插入片段的穩定性,而且能在誘導劑的作用下,即時擴增出高拷貝數的克隆而獲得高產量的DNA.
四、將基因組DNA片段連接入載體
使用連接酶把上述大小合適的DNA片段連接入載體.許多商業化載體已經經過預處理,可以直接使用,無需內切酶消化及脫磷酸化處理.選用連接快、效率高的連接酶,連接反應體系以100μl為宜.
注意：BAC載體連接完以后,需要將連接產物做脫鹽處理,除去連接反應緩沖液里的鹽分.
五、將重組載體轉入宿主細胞
如果構建黏粒文庫,需要用包裝蛋白來包裝上述的連接反應產物,測定包裝好的黏粒克隆的滴度,然后轉染.挑出重組子,鑒定插入片段的大小.如果文庫的大小和質量都令人滿意的話, 就可以鋪板進行文庫篩選,或者擴增、保存文庫.
如果構建BAC文庫,應選擇電轉法,將上述連接產物轉入受體菌,涂板長出克隆.獲得克隆后需要對BAC克隆的大小進行評估,確定文庫大小是否能夠滿足要求.如果文庫大小合適,就可以進行后續操作了.
六、文庫克隆數的確定
基因組DNA文庫需要包含足夠多的克隆,來保證文庫的代表性.一般使用如下的經驗公式來確定：
N = ln （1-P ） / ln （1-f ） P是希望得到的覆蓋率,f是插入片段大小與基因組DNA大小的比值,N是所需的克隆數.
舉例來說,用BAC載體構建人類基因組文庫,人類基因組大小為3 x 109 bp, 插入片段大小為100kb,希望覆蓋率99%,那么所需要的BAC克隆數為
N = ln （1 - 0.99） / ln （1 - [106bp / 3 x 109 bp]） = 138,298
資料：
材料
緩沖液和溶液
- 堿裂解液I , 4°C
50 mM 葡萄糖
25 mM Tris-Cl （pH 8.0）
10 mM EDTA （pH 8.0）
配制堿裂解液I 約100ml,滅菌,保存在四度.
- 堿裂解液II,新鮮配置,室溫保存
0.2 N NaOH （從10N的NaOH新鮮制備）
1% （w/v） SDS 堿裂解液II應該新鮮配制,室溫保存.
- 堿裂解液III, 4°C
5M 醋酸鉀,60ml
冰醋酸,11.5ml
SDW,28.5ml - 酒精
- 70%酒精 - 異丙醇 - 酚：氯 仿（1：1, v/v）
- 醋酸鈉（3M,pH5.2）
- STE,4°C
10 mM Tris-Cl （pH 8.0）
0.1 M NaCl
1 mM EDTA （pH 8.0）
- TE （pH 8.0）
10 mM Tris-Cl （pH 8.0）
10 mM EDTA （pH 8.0）
使用連接酶把上述大小合適的DNA片段連接入載體.許多商業化載體已經經過預處理,可以直接使用,無需內切酶消化及脫磷酸化處理.選用連接快、效率高的連接酶,連接反應體系以100μl為宜.
注意：BAC載體連接完以后,需要將連接產物做脫鹽處理,除去連接反應緩沖液里的鹽分.
五、將重組載體轉入宿主細胞
如果構建黏粒文庫,需要用包裝蛋白來包裝上述的連接反應產物,測定包裝好的黏粒克隆的滴度,然后轉染.挑出重組子,鑒定插入片段的大小.如果文庫的大小和質量都令人滿意的話, 就可以鋪板進行文庫篩選,或者擴增、保存文庫.
如果構建BAC文庫,應選擇電轉法,將上述連接產物轉入受體菌,涂板長出克隆.獲得克隆后需要對BAC克隆的大小進行評估,確定文庫大小是否能夠滿足要求.如果文庫大小合適,就可以進行后續操作了.
六、文庫克隆數的確定
基因組DNA文庫需要包含足夠多的克隆,來保證文庫的代表性.一般使用如下的經驗公式來確定：
N = ln （1-P ） / ln （1-f ） P是希望得到的覆蓋率,f是插入片段大小與基因組DNA大小的比值,N是所需的克隆數.
舉例來說,用BAC載體構建人類基因組文庫,人類基因組大小為3 x 109 bp, 插入片段大小為100kb,希望覆蓋率99%,那么所需要的BAC克隆數為
N = ln （1 - 0.99） / ln （1 - [106bp / 3 x 109 bp]） = 138,298
資料：
材料
緩沖液和溶液
- 堿裂解液I , 4°C
50 mM 葡萄糖
25 mM Tris-Cl （pH 8.0）
10 mM EDTA （pH 8.0）
配制堿裂解液I 約100ml,滅菌,保存在四度.
- 堿裂解液II,新鮮配置,室溫保存
0.2 N NaOH （從10N的NaOH新鮮制備）
1% （w/v） SDS 堿裂解液II應該新鮮配制,室溫保存.
- 堿裂解液III, 4°C
5M 醋酸鉀,60ml
冰醋酸,11.5ml
SDW,28.5ml - 酒精
- 70%酒精 - 異丙醇 - 酚：氯 仿（1：1, v/v）
- 醋酸鈉（3M,pH5.2）
- STE,4°C
10 mM Tris-Cl （pH 8.0）
0.1 M NaCl
1 mM EDTA （pH 8.0）
- TE （pH 8.0）
10 mM Tris-Cl （pH 8.0）
10 mM EDTA （pH 8.0）
載體與菌株 BAC轉化的大腸桿菌
培養基和抗生素含12.5μg/ml氯霉素的LB平板和液體培養基
酶和緩沖液
溶菌酶
RNaseA,不含DNase
限制性內切酶和相應緩沖液
核苷酸/寡核苷酸
用于脈沖場凝膠電泳（pulsed-field gel electrophoresis）的DNA
標準參照物
凝膠/點樣緩沖液
脈沖場凝膠電泳（Pulsed-field gels,或者0.5%瓊脂糖凝膠） 離心機/轉頭/離心管
其他 37攝氏度搖床
1.BAC DNA大量提取方案（參考文獻：Molecular cloning: A Laboratory Manual Third Edition）
此方案適合從500ml的菌液中提取BAC DNA,一般可以產生20-25μg純化的DNA.
方法
1.將50μl BAC轉化菌的過夜培養物接種到500ml含12.5μg/ml氯霉素的LB液體培養基中,37℃震蕩（280rpm）培養12到16小時.
2.2500g,4℃,離心15min,收集菌體.
3.用100ml冰預冷的STE重新懸浮細菌沉淀.按步驟2方法離心收集細菌.
4.用24ml含RNase（100μg/ml）的堿性裂解液I溶解細菌.加溶菌酶至終濃度為1mg/ml.
5.加入24ml新鮮配置的堿性裂解液II.蓋緊離心瓶蓋,輕輕翻轉瓶子數次,使內容物*混勻,冰裕5min.
6.加入24ml冰預冷的堿性裂解液III,蓋緊瓶蓋,輕輕翻轉瓶子數次,使內容物*混勻,置冰上5min.
7.15000g,4℃,離心10min,將上清轉移到另一離心瓶中,棄沉淀.
8.加等體積的酚：氯 仿.輕輕翻轉離心瓶數次,混勻.3000g,室溫離心15min.
9.將水相移至另一離心瓶中,加入等體積的異丙醇,翻轉離心瓶數次,混勻.
10.15,000g,室溫離心15分鐘,回收核酸沉淀.
11.棄上清,用20ml 70%乙醇漂洗沉淀.
12.棄乙醇,風干使乙醇揮發殆盡.
13.小心將BAC DNA沉淀溶于0.2ml TE （pH8.0） 中.
2.BAC DNA的小量提取（參考文獻：Molecular cloning: A Laboratory Manual Third Edition）
此方案適合從5ml菌液中提取BAC DNA,一般可以產生0.1-0.4μg的BAC DNA.
方法：
1.挑取單菌落接種至5ml含12.5μg/ml氯霉素的LB培養基中,37℃劇烈震搖過夜.
2.2000g,4℃,離心5min,收集菌體.
3.在每個離心管中加5ml預冷的STE,用移液器吹懸細菌沉淀.按步驟2離心收集細菌.
4.將菌體重懸于200ul冰冷的堿性裂解液I中.將菌體轉移至預冷的微量離心管中,置于冰上.
5.向管中加入400μl新鮮配置的堿性裂解液II.輕輕翻轉數次,將離心管置于冰上.
6.向管中加入300μl冰冷的堿性裂解液III,輕輕翻轉數次.將離心管置于冰上5min.
7.在微量離心機上以zui大速度4℃離心5min,除去細胞碎片沉淀.將上清移入一新的微量離心管中.室溫下加入900μl異丙醇,輕輕翻轉數次離心管,混勻.
8.立即在微量離心機上室溫下zui大速離心5min,使核酸沉淀.棄去上清,用1ml 70%乙醇小心漂洗.室溫下離心2min,吸去乙醇.室溫干燥沉淀5-10min后,將沉淀溶于50μl TE（pH8.0）中.
培養基和抗生素含12.5μg/ml氯霉素的LB平板和液體培養基
酶和緩沖液
溶菌酶
RNaseA,不含DNase
限制性內切酶和相應緩沖液
核苷酸/寡核苷酸
用于脈沖場凝膠電泳（pulsed-field gel electrophoresis）的DNA
標準參照物
凝膠/點樣緩沖液
脈沖場凝膠電泳（Pulsed-field gels,或者0.5%瓊脂糖凝膠） 離心機/轉頭/離心管
其他 37攝氏度搖床
1.BAC DNA大量提取方案（參考文獻：Molecular cloning: A Laboratory Manual Third Edition）
此方案適合從500ml的菌液中提取BAC DNA,一般可以產生20-25μg純化的DNA.
方法
1.將50μl BAC轉化菌的過夜培養物接種到500ml含12.5μg/ml氯霉素的LB液體培養基中,37℃震蕩（280rpm）培養12到16小時.
2.2500g,4℃,離心15min,收集菌體.
3.用100ml冰預冷的STE重新懸浮細菌沉淀.按步驟2方法離心收集細菌.
4.用24ml含RNase（100μg/ml）的堿性裂解液I溶解細菌.加溶菌酶至終濃度為1mg/ml.
5.加入24ml新鮮配置的堿性裂解液II.蓋緊離心瓶蓋,輕輕翻轉瓶子數次,使內容物*混勻,冰裕5min.
6.加入24ml冰預冷的堿性裂解液III,蓋緊瓶蓋,輕輕翻轉瓶子數次,使內容物*混勻,置冰上5min.
7.15000g,4℃,離心10min,將上清轉移到另一離心瓶中,棄沉淀.
8.加等體積的酚：氯 仿.輕輕翻轉離心瓶數次,混勻.3000g,室溫離心15min.
9.將水相移至另一離心瓶中,加入等體積的異丙醇,翻轉離心瓶數次,混勻.
10.15,000g,室溫離心15分鐘,回收核酸沉淀.
11.棄上清,用20ml 70%乙醇漂洗沉淀.
12.棄乙醇,風干使乙醇揮發殆盡.
13.小心將BAC DNA沉淀溶于0.2ml TE （pH8.0） 中.
2.BAC DNA的小量提取（參考文獻：Molecular cloning: A Laboratory Manual Third Edition）
此方案適合從5ml菌液中提取BAC DNA,一般可以產生0.1-0.4μg的BAC DNA.
方法：
1.挑取單菌落接種至5ml含12.5μg/ml氯霉素的LB培養基中,37℃劇烈震搖過夜.
2.2000g,4℃,離心5min,收集菌體.
3.在每個離心管中加5ml預冷的STE,用移液器吹懸細菌沉淀.按步驟2離心收集細菌.
4.將菌體重懸于200ul冰冷的堿性裂解液I中.將菌體轉移至預冷的微量離心管中,置于冰上.
5.向管中加入400μl新鮮配置的堿性裂解液II.輕輕翻轉數次,將離心管置于冰上.
6.向管中加入300μl冰冷的堿性裂解液III,輕輕翻轉數次.將離心管置于冰上5min.
7.在微量離心機上以zui大速度4℃離心5min,除去細胞碎片沉淀.將上清移入一新的微量離心管中.室溫下加入900μl異丙醇,輕輕翻轉數次離心管,混勻.
8.立即在微量離心機上室溫下zui大速離心5min,使核酸沉淀.棄去上清,用1ml 70%乙醇小心漂洗.室溫下離心2min,吸去乙醇.室溫干燥沉淀5-10min后,將沉淀溶于50μl TE（pH8.0）中.