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               羥脯氨酸(Hyp)檢測(cè)原理說(shuō)明

（               測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)液）

一、原理 羥脯氨酸在氧化劑的作用下所產(chǎn)生的氧化產(chǎn)物與二甲氨基苯甲醛作用呈現(xiàn)紫紅色，

根據(jù)其呈色的深淺可推算出其含量。 二、試劑盒組成與配制：

1、試劑一：粉劑×2 瓶，甲液 10ml×2 瓶，乙液 20ml×2 瓶，臨用時(shí)取粉劑一瓶，先加 甲液混勻 10ml 充分溶解（從瓶口向內(nèi)看，*溶解完）。然后再加乙液 20ml 充分混勻。配好后的試劑 4℃~8℃冰箱保存。

注意點(diǎn)：粉劑加甲液 10ml 后一定一定要*溶解后才能加乙液。

2、試劑二：液體 60ml×1 瓶，4℃冰箱避光保存。

3、試劑三：粉劑×1 支，溶劑 60ml×1 瓶，臨用時(shí)將粉劑一支加到 60ml 溶劑中充分溶解， 配好后 4℃避光保存。

4、試劑四：羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品 5mg×3 支，4℃冰箱保存。

標(biāo)準(zhǔn)貯備液的配制：測(cè)試前將一支標(biāo)準(zhǔn)品用蒸餾水溶解后定溶至 50ml，配成 100μg/ml 的標(biāo)準(zhǔn)貯備 液。

2μg/ml 標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液的配制：取 100μg/ml 的標(biāo)準(zhǔn)貯備液 0.2ml 加蒸餾水定溶至 10ml，配成 2μg/ml

的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

5、消化液：粉劑×1 瓶，溶劑 3ml×1 瓶，4℃冰箱保存。臨用前將粉劑倒入溶劑中，并 用溶劑將粉劑瓶洗干凈，現(xiàn)用現(xiàn)配。

*注意：混勻時(shí)用雙手小心旋動(dòng)小瓶，切勿上下顛倒混勻，以免引起大量氣泡。

三、操作步驟：

1、樣本前處理：（血清及體液可直接進(jìn)行檢測(cè)，組織則需制成勻漿后檢測(cè)。） 組織塊稱重，放在勻漿管口部，用小剪刀剪碎，加入 9 倍生理鹽水沖入勻稱管

中，緩慢上下旋轉(zhuǎn)研磨，每次半分鐘，間隔半分鐘，反復(fù) 5 次或者用勻漿機(jī)，勻漿時(shí)間

10 秒/次，間隔 30 秒，連續(xù) 3~5 次，在冰水中進(jìn)行。勻漿后以 3500 轉(zhuǎn)/分離心 10 分鐘， 取上清 0.1ml 加 0.4ml 生理鹽水，稀釋成 2%的組織勻漿進(jìn)行檢測(cè)，或者取 0.05ml 10%勻 漿加生理鹽水 0.45ml 制備成 1%勻漿，請(qǐng)做預(yù)試后再確定勻漿濃度。（詳見(jiàn)實(shí)驗(yàn)方法學(xué)）。

2、消化：

	空白管	標(biāo)準(zhǔn)管	測(cè)定管
雙蒸水（ml）	0.25
2μg/ml 標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液 （ml）		0.25
檢測(cè)液（ml）			0.25
消化液（ml）	0.05	0.05	0.05

3、羥脯氨酸測(cè)定：

混勻，37℃水浴 3 小時(shí)

試劑一（ml）

0.5

0.5

0.5

混勻，室溫靜置 10 分鐘

試劑二（ml）

0.5

0.5

0.5

混勻，室溫靜置 5 分鐘

試劑三（ml）

1.0

1.0

1.0

混勻，60℃水浴 15 分鐘，流水冷卻后，3500 轉(zhuǎn)/分離心 10 分鐘，取上清（注

意不要混入下面沉淀）在 550nm 處，1cm 光徑，蒸餾水調(diào)零，測(cè)各管吸光度。

注意：若您的樣本中所含羥脯氨酸過(guò)低，可以增加您的樣本取樣量或增加勻漿濃度。

4、蛋白定量。

四、計(jì)算與舉例：

1、公式：

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