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一次實驗，四種作用：用四唑鹽比色法實驗查看細胞的生長與其存活
閱讀：1509 發布時間：2014-3-6 實驗有其目的有其原理，您看題目知道我們本次的實驗是查看細胞的生長存活，我們今天使用的方法名稱為四唑鹽比色法，四唑鹽也叫MTT。本次實驗有些特別哦！實驗的作用出標題中目的，還有兩個，它還可以大規模的抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定、生物活性因子的活性檢測。
一次實驗，四種作用：用四唑鹽比色法實驗查看細胞的生長與其存活。在實驗之前您需要先了解一下應該明確知道哪些問題，當然啦，上海恒遠已經為您整理出來了，下面我們來分條逐步看：
1、選擇適當的細胞接種濃度。一般情況下，96孔培養板的一內貼壁細胞長滿時約有105個細胞。但由于不同細胞貼壁后面積差異很大，因此，在進行MTT試驗前，要進行預實驗檢測其貼壁率、倍增時間以及不同接種細胞數條件下的生長曲線，確定試驗中每孔的接種細胞數和培養時間，以保證培養終止致細胞過滿。這樣，才能保證MTT結晶形成酌量與細胞數呈的線性關系。否則細胞數太多敏感性降低，太少觀察不到差異。
2、藥物濃度的設定。一定要多看文獻，參考別人的結果再定個比較大的范圍先初篩。根據自己初篩的結果縮小濃度和時間范圍再細篩。不然可能你用的時間和濃度根本不是藥物的有效濃度和時間。
3、時間點的設定。在不同時間點的測定OD值，輸入excel表，zui后得到不同時間點的抑制率變化情況，畫出變化的曲線，曲線什么時候變得平坦了那個時間點應該就是的時間點，因為這個時候的細胞增殖抑制表現的zui明顯。
4、培養時間。200 ul的培養液對于10的4~5次方的增殖期細胞來說，很難維持68 h，如果營養不夠的話，細胞會由增殖期漸漸趨向G0期而趨于靜止，影響結果，我們是在48 h換液的。
5、MTT法只能測定細胞相對數和相對活力，不能測定細胞數。做MTT時，盡量無菌操作，因為細菌也可以導致MTT比色OD值的升高。
6、理論未必都是對的。要根據自己的實際情況調整。
7、實驗時應設置調零孔，對照孔，加藥孔。調零孔加培養基、MTT、二甲基亞砜。對照孔和加藥孔都要加細胞、培養液、MTT、二甲基亞砜，不同的是對照孔加溶解藥物的介質，而加藥組加入不同濃度的藥物。
8、避免血清干擾。用含15%胎牛血清培養液培養細胞時，高的血清物質會影響試驗孔的光吸收值。由于試驗本底增加，會試驗敏感性。因此，一般選小于10%胎牛血清的培養液進行。在呈色后，盡量吸凈培養孔內殘余培養液。
第二部是貼壁細胞：
1、收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度，每孔加入100 ul，鋪板使待測細胞調密度至1 000-10 000孔，邊緣孔用無菌PBS填充。
2、5% CO2，37℃孵育，至細胞單層鋪滿孔底（96孔平底板），加入濃度梯度的藥物，原則上，細胞貼壁后即可加藥，或兩小時，或半天時間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥。一般5-7個梯度，每孔100 ul，設3-5個復孔.建議設5個，否則難以反應真實情況。
3、5% CO2，37℃孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。
4、每孔加入20 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5% MTT），繼續培養4 h。若藥物與MTT能夠反應，可先離心后棄去培養液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養液。
5、終止培養，小心吸去孔內培養液。
6、每孔加入150 ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。
7、同時設置調零孔（培養基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞砜）。
做完了貼壁細胞之后，我們再看看懸浮細胞：
1、收集對數期細胞，調節細胞懸液濃度1×106/ml，按次序將
① 補足的1640（無血清）培養基40 ul ；
② 加Actinomycin D（有毒性）10 ul用培養液稀釋 （儲存液100 ug/ml，需預試尋找*稀釋度，1：10-1：20）；
③ 需檢測物10 ul；
④ 細胞懸液50 ul（即5×104cell/孔），共100 ul加入到96孔板（邊緣孔用無菌水填充）。每板設對照（加100 ul 1640）。
2、置37℃，5% CO2孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。
3、每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5% MTT），繼續培養4 h。（懸浮細胞推薦使用WST-1，培養4 h后可跳過步驟4），直接酶聯免疫檢測儀OD570nm（630nm校準）測量各孔的吸光值）
4、離心（1000轉x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD570nm（630nm校準）測量各孔的吸光值。
5、同時設置調零孔（培養基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞砜），每組設定3復孔。
MTT的配制：一般現用現配，過濾后4oC避光保存兩周內有效，或配制成5mg/ml保存在-20度長期保存，避免反復凍融，小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分裝在EP管里，用的時候現配，直接往培養板中加，沒必要一下子配那么多，尤其當MTT變為灰綠色時就不能再用了。
上海恒遠提醒您：MTT有致癌性，用的時候小心，有條件帶那種透明的簿膜手套。配成的MTT需要無菌，MTT對菌很敏感；往96孔板加時不避光也沒有關系，畢竟時間較短，或者你不放心的時候可以把操作臺上的照明燈關掉.
配制MTT時用PBS溶解，也有人用生理鹽水配，60℃水浴助溶。
1、PBS配方
① NaCl ：8 g。
② KCl 0.2：g。
③ Na2HPO4 ：1.44 g。
④ KH2PO4：0.24 g。
⑤ 調pH7.4。
⑥ 定容1 L。
zui后一步啦，細胞的接種（鋪板）：
細胞過了30代以后就不要用了，因為狀態不好了；培養板要用好的（進口板），不好的板或重復利用的板只可做預實驗。接種時按照預實驗摸索出的密度接種， 因為細胞密度在10000/ml左右時，所測得的OD值的區間即細胞抑制率（或者增值率）的所呈現的線性關系，結果zui可信。如果鋪的太稀細胞的殺傷不會很明顯，太密細胞可能都會凋亡，因為細胞長的太快營養會不夠，zui后導致死亡。且而細胞過密或者過少，增殖都會過快或者過慢，其增值率線性關系不佳。故而MTT細胞密度多采用10000/ml，100 ul/孔。
細胞密度要根據不同細胞的特點來定.如果你做的藥品對細胞具有刺激作用那么取小點的細胞濃度，如果你做的藥品對細胞具有抑制作用那么取大點的細胞濃度，這樣與對照的區別更明顯，數據更好。懸浮細胞每孔的細胞數可達到105，貼壁細胞可為103-104。
到這里就算是基本說完了，本實驗有點復雜，所以朋友們要小心并且有耐心哦！zui后呢，上海恒遠在這里再給朋友們說說實驗中有哪些注意事項。首先就要選擇適當得細胞接種濃度，還有要避免血清干擾，一般選小于10％的胎牛血清的培養液進行試驗，在呈色后盡量吸盡孔內殘余培養液。設空白對照：與試驗平行不加細胞只加培養液的空白對照。其他試驗步驟保持一致，zui后比色以空白調零。MTT實驗吸光度zui后要在0-0.7之間，超出這個范圍就不是直線關系，IC50是半抑制率，意思是抑制率50％的時候藥物的濃度。把藥品稀釋成不同的濃度，然后計算各自的抑制率，以藥品的濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標作圖，然后得到50％抑制率時候的藥品濃度，就是IC50。
一次實驗，四種作用。感謝您對本公司的支持，我公司的產品質量都是可以保證的，并且試劑盒提供免費代測，其它產品實驗中，您有任何問題都可以來電，我們可提供實驗技術指導。歡迎您電詢上海恒遠何。