化工儀器網(wǎng)
技術(shù)文章
[ELISA試劑盒]核酸的抽提---mRNA提取分離技巧
閱讀：1626 發(fā)布時間：2012-11-19[ELISA試劑盒]核酸的抽提---mRNA提取分離技巧
與rRNA 和tRNA 不同的是，哺乳動物細胞的絕大部分mRNA 在其3'端均有一poly（A）尾，因此可以用oligo（dT）－纖維素親和層析法從大量的細胞RNA 中分離mRNA dmonds等，1971;At Leder，1972）。在構(gòu)建cDNA文庫時， 必須經(jīng)上述純化步驟制備mRNA 模板。
進行Northern雜交或Sl 核酸酶作用圖分析時，與總RNA 相比，采用poly（A）+ RNA 能獲得更為滿意的結(jié)果。 可以按照Gilham（1964）所述方法制備Oligo（dT）－纖維素，也可以買現(xiàn)成的產(chǎn)品。
1）用0.1mol/L NaOH懸浮0.5-1.0g 0ligo（dT）－纖維素。
2）將懸浮液裝入滅菌的一次性層析柱或裝入填有經(jīng)用DEPC處理并經(jīng)高壓滅菌的玻璃棉的巴期德吸管中，柱床體積為0.5-1.0ml，用3倍柱床體積滅菌水沖洗柱床。柱床體積為1m的oligo（dT）－纖維素zui大量為10mg總RNA ，如果總RNA 的量較少，則應減少oligo（dT）－纖維素的使用量以防止poly（A）+RNA 在過柱以及后續(xù)步驟中損失。
3）用無菌的1x層析柱加樣緩沖液沖洗柱床直至流出液的pH值小于8.0。1x層析柱加樣緩沖液
20mmol/L Tris.Cl（pH7.6）
0.5mol/L NaCl
1mmol/L EDTA（pH8.0）
0.1%SDS
可按以下方法制備滅菌的層析柱加樣緩沖液；將適量無RNA 酶的Tris. Cl（pH7.6）、氯化鈉和EDTA貯存液混合在15lbf/in2（1.034x105Pa）高壓下蒸氣滅菌，待其次序卻至65℃左右時加入已在 65℃預熱30分鐘的10 %SDS貯存液。也可以用0.05mol/L檸檬酸鈉代替Tris.Cl 然后用DEPC處理檸檬鈉－NaCL-EDTA和SDS的混合溶液。
4）用滅菌水溶解RNA ，于65℃溫育5分鐘后使迅速冷卻至室溫，加等體積的2x層析柱加樣緩沖液，上樣，立即用滅菌的試管收集洗液。當所的RNA 溶液均進入柱床后，加1倍體積的1x層析柱加樣 ，繼續(xù)收集洗出液。加熱RNA 可以破壞可能涉及poly（A）尾的二級結(jié)構(gòu)。
5）當全部溶液流出后，將收集液置于65℃溫育5分鐘，重新上樣，并收集流出液。
6）用5-10倍柱床體積的1x層析柱加樣緩沖液洗柱，分部收集洗出液，測定每一收集管的OD260。zui補由于不帶poly）A）的RNA 洗過柱床， OD260會很高，后來OD260值則很小或為零。在某些方案中，上述步驟后還用5倍柱術(shù)體積的含0.1mol/L NaCl的1x 層析柱加樣緩沖液洗柱床，然而由于洗出的不帶poly（A）的RNA 很少甚至沒有， 因此這一步驟可以省略。
7）用2－3倍柱床體積的經(jīng)滅菌且無RNA 酶的洗脫緩沖液洗脫mRNA ，以1/3－1/2柱床體積分部收集洗脫液。洗脫緩沖液
10mmol/L Tris.Cl（pH7.6）
1mmol/L EDTA（pH8.0）
0.05%SDS
用于配制洗脫緩沖液的Tris. Cl 和EDTA貯存液應為新近高壓的溶液 可用適量的滅菌水稀釋上述貯存液配制洗脫緩沖液。洗脫緩沖液不能高壓處理，因高壓會使溶產(chǎn)生大量氣泡。
8）收集液置于透明的小溶器內(nèi)，測定OD260，使用前比色杯須用濃鹽酸：甲醇（1：1）浸泡1小時，再用經(jīng)DEPC處理并高壓處理過的水*沖洗合并含有RNA 的洗脫組分。經(jīng)上述一輪oligo（dT）－纖維素親和量層析后得到的RNA 中，帶與不帶poly（A）的RNA ，其含量近乎相等。如欲進一步純化mRNA ，可將洗脫液于65 ℃溫育3分鐘，迅速冷卻至室溫，加入NaCl至終濃度為0.5mol/L，用同一oligo（dT）纖維素柱進行第二輪層析。
9）收集oligo（dT）－纖維素柱層析的洗脫液，在mRNA 溶液中加入3mol/L乙酸鈉（pH5.2）至終深度為0.3mol/L并混勻。加2.5 倍體積用冰預冷的乙醇，混勻，冰浴至少30分鐘。
10）于4℃以10 000g離心15分鐘回收poly（A）+RNA ，小心棄去上清液，用70%乙醇洗滌沉淀（通常看不見沉淀），離心片刻，在空氣中晾干核酸沉淀。
11）用少量水重溶RNA ，置于比色杯內(nèi)，測定OD260， 使用前比色杯須用濃鹽酸：甲醇（1：1）浸泡1小時，再用經(jīng)DEPC處理并高壓處理過的水*沖洗
12）將mRNA 溶液由比色杯移至聚丙烯離心管內(nèi)，加3倍體積乙醇， 混勻，于－70℃保存?zhèn)溆谩；厥誖NA 時，只需取出一小份貯存液，加3mol/K乙酸鈉（pH5.2）至終濃度為0.3mol/L， 混勻，用微量離心機于4℃以12 000g離心5分鐘即可。
i.OD260＝1的溶液其RNA 含量約為40μg/ml。
ii.從107個哺乳動物培養(yǎng)細胞中可獲得1－5μg mRNA ，所得mRNA 通常只占上柱的總RNA 的1～2%
上海恒遠生物專業(yè)生產(chǎn)多個系列ELISA試劑盒，包括細胞因子系列、白介素試劑盒、干擾素IFN系列、腫瘤壞死因子TNF系列、心肌梗塞系列、內(nèi)分泌系列、肝纖維化系列、自身免疫系列、腫瘤標志物系列、優(yōu)生優(yōu)育系列、傳染病系列、特種蛋白系列等，可檢測人（Human）、大鼠（Rat）、小鼠（Mouse）、猴（Monkey）、兔（Rabbit）、豬（Pig）、馬（Horse）、魚、雞、鴨、羊等多種樣本。
上海恒遠本著服務科研，以質(zhì)量求生存，以信譽求發(fā)展的精神，精益求精，力求做到更好。全體員工孜孜不倦為國內(nèi)科研事業(yè)單位以及高校等提供的產(chǎn)品服務！在廣大客戶的支持和全體員工的努力下，公司正在日益發(fā)展和壯大。不管是過去還是現(xiàn)在和將來，公司全體員工將再接再厲，以的服務態(tài)度，全新的精神面貌，為廣大新老客戶，提供的產(chǎn)品和售后服務，讓我們攜手共創(chuàng)美好未來。