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大鼠肺纖維化模型中 NLＲP3、IL-18 表達(dá)及意義的探討

孫云暉 王一新 馬雪梅 楊曉東 李樹民

【摘要】 目的 觀察博來霉素致肺纖維化大鼠肺組織中 NLＲP3、IL-18 的表達(dá)水平，探討其在肺纖維化發(fā)生、發(fā)展中的意義。方法 將 45 只清潔級(jí) Wistar 大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為健康對(duì)照組( N 組) 、博來霉素組( B 組) 、地塞米松治療組( D 組) ，每組大鼠各 15 只，B 組及 D 組大鼠給予氣管內(nèi)注射博來霉素 4mg /kg 制作肺纖維化模型，N 組給予相同體積生理鹽水作為對(duì)照，D 組大鼠于肺纖維化造模基礎(chǔ)上第 2 天每日腹腔注射地塞米松 3mg /kg，N、B 組大鼠腹腔注射生理鹽水作為對(duì)照。各組大鼠分別于造模后 7、14、28 處死，HE 染色評(píng)價(jià)肺組織病理形態(tài)學(xué)變化，堿水解法及酶聯(lián)免疫吸附法分別測(cè)定肺組織勻漿中羥脯氨酸( HYP) 、NLＲP3含量，ＲT-PCＲ 法測(cè)定肺組織中 IL-18mＲNA 表達(dá)量。結(jié)果 ( 1) HE 染色示 B、D 組大鼠第 7 天肺間質(zhì)和肺泡腔內(nèi)可見大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，此后炎癥隨時(shí)間推移逐漸減輕，逐漸發(fā)展為晚期纖維化性變; B、D 組 HYP 含量隨時(shí)間推移逐漸升高，以 28 天為著，P ＜ 0. 05; ( 2) B、D 組 NLＲP3、IL-18mＲNA 表達(dá)于第 7 天升高至zui高點(diǎn)，后逐漸降低，至 28 天均高于 N 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＜ 0. 05) ; ( 3) D 組 NLＲP3、IL-18mＲNA 表達(dá)在同一時(shí)間均低于 B 組，P ＜ 0. 05。結(jié)論 NLＲP3、IL-18 在大鼠肺纖維化發(fā)病早期起重要作用，可能參與了肺纖維化發(fā)生與發(fā)展。

【關(guān)鍵詞】 肺纖維化; NLＲP3; IL-18; 博來霉素特發(fā)性肺纖維化是間質(zhì)性肺炎中常見的一種，高發(fā)于老年人群，以胸膜下肺基底部分布為主，HＲCT 上可表現(xiàn)有數(shù)量不等、范圍有限的磨玻璃影及網(wǎng)格影［1］。有研究報(bào)道肺纖維化是由肺組織受到損傷后，修復(fù)調(diào)節(jié)失控及重建異常引起的病理改變，是一系列細(xì)胞因子、炎性因子、生長(zhǎng)因子等通過多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路共同作用的結(jié)果［2］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，肺組織損傷可導(dǎo)致組織蛋白酶及 ＲOS 大量釋放，誘導(dǎo)炎癥小體( NLＲP3) 高表達(dá)，參與慢性炎癥形成［3］。白細(xì)胞介素-18( Ilterleukin-18，IL-18) 通過調(diào)控多種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)炎癥發(fā)生，細(xì)胞分化，細(xì)胞因子等作用［4］。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠氣管滴注博來霉素制作肺纖維化動(dòng)物模型，旨在探討NLＲP3 /IL-18 軸在博來霉素致大鼠肺纖維化中的表達(dá)及作用機(jī)制，可為闡明這類疾病發(fā)病機(jī)制及為治療提供新思路。資料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
健康清潔級(jí) Wistar 大鼠 45 只( 雌雄各半) ，6 周齡，體重 180 － 220g，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供［許可證號(hào): SCXK( 黑) 2013-001］，隨機(jī)分為健康對(duì)照組( N 組) 、博來霉素組( B 組) 和地塞米松治療組( D 組) ，每組各 15 只大鼠，于佳木斯大學(xué)動(dòng)物中心飼養(yǎng)。
二、實(shí)驗(yàn)材料與試劑
注射用鹽酸博來霉素 BLM( 海正輝瑞制藥有限公司提供) ，HE 染色試劑( 湖北錦源醫(yī)療科技有限公司提供) ; Nikon eclipse 50i 顯微鏡( 北京中儀光科科技發(fā)展有限公司提供) ; NLＲP3 大鼠 ELISA 試劑
盒( 上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司提供)

三、模型建立及標(biāo)本留取
B、D 組以 4mg /kg 劑量博來霉素一次性快速推注至氣管內(nèi)，N 組給予等體積生理鹽水。D 組大鼠于肺纖維化造模基礎(chǔ)上第 2 日開始每日腹腔注射地塞米松 3mg /kg，N、B 組大鼠腹腔注射生理鹽水作為對(duì)照。各組大鼠于造模后分別于 7、14、28 天處死，取右上肺組織置于 10% 甲醛溶液中固定、脫水、石蠟包埋、常規(guī)切片 HE 染色，觀察肺組織結(jié)構(gòu)的病理形態(tài)學(xué)變化; 從左肺組織上留取 50mg 肺組織，制備組 織 勻 漿，用 于 HYP、IL-37 檢 測(cè); 取 右 肺 組 織100mg，放入 Eppendorf 管內(nèi)，－ 80℃ 保存，用于檢測(cè)IL-18mＲNA 表達(dá)水平。
四、實(shí)驗(yàn)方法
堿水解法測(cè)定肺組織 HYP 含量，ELISA 法檢測(cè)肺組織 NLＲP3 表達(dá)水平，均嚴(yán)格按照試劑盒說明書
進(jìn)行操作。
五、ＲT-PCＲ 檢測(cè)肺組織 IL-18mＲNA 表達(dá)水平提取肺組織總 ＲNA，反轉(zhuǎn)錄為 cDNA。目的基因 IL-18mＲNA 上 游 引 物: 5'-GAGGACTGGCTGTGACCCTATC-3'，下游引物 5'-CCTGGCACACGTTTCTGAAA-3'，擴(kuò)增片段 151bp: 內(nèi)參照 β-actin mＲNA 上游引物: 5'-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3'，下游引物 5'-TTTAATGTCACGCACGATTTC -3'，擴(kuò) 增 片 段150bp。PCＲ 反應(yīng)條件按照試劑盒說明書進(jìn)行。
六、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
采用 SPSS22. 0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析 實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用 x珋± s 表示，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較應(yīng)用 LSD-t 檢驗(yàn)，以 P ＜ 0. 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

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