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滋陰補(bǔ)陽方序貫療法對多囊卵巢綜合征（ＰＣＯＳ）大鼠卵巢顆粒細(xì)胞（ＧＣ）分泌功能和細(xì)胞因子基因表達(dá)的影響

徐括琴１，尹巧芝２，黨麗英１，侯玉華１，楊小風(fēng)１

１．鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院  婦產(chǎn)科（鄭州４５００００），２．成都中醫(yī)藥大學(xué)婦科教研室（成都６１００７５）

摘 要 目的：研究滋陰補(bǔ)陽方序貫療法對多囊卵巢綜合征（ＰＣＯＳ）大鼠卵巢顆粒細(xì)胞（ＧＣ）分泌功能和細(xì)胞因子基因表達(dá)產(chǎn)生的影響。方法：利用隨機(jī)數(shù)字表法將實(shí)驗(yàn)雌性性ＳＤ 大鼠分為３ 組，包括空白對照組、滋陰組以及補(bǔ)陽組；選取６ 周齡同樣大鼠灌胃，調(diào)配空白血清與用藥血清；對ＰＣＯＳ大鼠 ＧＣ 及黃素化顆粒細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)，并以隨機(jī)方法分為１０組，比較各組細(xì)胞培養(yǎng)液里

面雌二醇（Ｅ２）、類胰島素增長因子（ＩＧＦ－１）、干細(xì)胞因子（ＳＣＦ）以及睪酮（Ｔ）水平，并觀察ＳＣＦ ｍＲ－ ＮＡ 表達(dá)情況。結(jié)果：模型組１ＧＣ 里面 Ｅ２ 水平明顯低于對照組（Ｐ ＜０．０５），且 ＳＣＦ 水平明顯高于

對照組；滋陰方組２ＳＣＦ 與滋陰方組３ＳＣＦ 水平均明顯低于模型組１（Ｐ ＜０．０５），而滋陰方組２Ｅ２

與滋陰方組３Ｅ２水平均明顯高于模型組１（Ｐ＜０．０５）；模型組１大鼠 ＧＣＳＣＦ ｍＲＮＡ 表達(dá)明顯高于對照組，且ＩＧＦ－１灰度值明顯小于對照組（Ｐ＜０．０５），滋陰方組２ 與滋陰方組３ＧＣＳＣＦ ｍＲＮＡ 表達(dá)均顯著低于模型組１（Ｐ＜０．０５），滋陰方組３ＩＧＦ－１ 灰度值明顯高于模型組１（Ｐ ＜０．０５）；模型組大鼠卵巢部位黃素化顆粒細(xì)胞里面Ｔ 水平明顯高于對照組（Ｐ＜０．０５）；補(bǔ)陽方組２與補(bǔ)陽方組３Ｔ水平明顯低于模型組（Ｐ＜０．０５），而補(bǔ)陽方組１Ｔ 水平與模型組的比較無顯著差異（Ｐ＞０．０５）；對照組、模型組、補(bǔ)陽方組黃素化顆粒細(xì)胞里面ＳＣＦ 水平、ＳＣＦ ｍＲＮＡ 表達(dá)以及ＩＧＦ－１灰度值比較無顯

著差異（Ｐ＞０．０５）。結(jié)論：對ＰＣＯＳ采取滋陰補(bǔ)陽方序貫療法，能提高 ＧＣ 分泌功能，同時(shí)可以降低卵泡期ＳＣＦ 基因在體內(nèi)的表達(dá)實(shí)現(xiàn)，可為ＰＣＯＳ排卵障礙臨床治療提供依據(jù)。

主題詞     多囊卵巢綜合征／中醫(yī)藥療法     ＠滋陰補(bǔ)陽方     大鼠     動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)

中圖分類號：Ｒ７３７．３１  文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Ａ  ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊｉ．ｓｓｎ．１０００－７３６９．２０１７．０７．０８３

多囊卵巢綜合征（Ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｃｏｖａｒｉａｎｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＰＣＯＳ）是與各器官、系統(tǒng)正常內(nèi)分泌紊亂相關(guān)的疾病，患者臨床表現(xiàn)具 有多樣化特點(diǎn)，現(xiàn)今其病理機(jī)制缺乏統(tǒng)一結(jié)論。有報(bào)道指出， 育齡婦女群體 ＰＣＯＳ發(fā)病率高達(dá)５％ ～１０％ ，并且和７５％ 左右無排卵性不孕患者密切相關(guān)［１］。亦有研究顯示，部分卵巢局部調(diào)節(jié)因子的表達(dá)和 ＰＣＯＳ 發(fā)病存在緊密聯(lián)系［２］。干細(xì)胞因子

（Ｓｔｅｍｃｅｌｌｆａｃｔｏｒ，ＳＣＦ）屬于卵巢局部相對重要的一種生長因子，可對細(xì)胞增殖分化產(chǎn)生促進(jìn)作用。現(xiàn)階段，與 ＳＣＦ 在 Ｐ－ ＣＯＳ患者卵巢局部產(chǎn)生的促進(jìn)作用相關(guān)研究較多，可是涉及ＳＣＦ 在 ＰＣＯＳ臨床發(fā)病機(jī)制中作用的研究卻不多。本文以大鼠實(shí)驗(yàn)，探討滋陰補(bǔ)陽方序貫療法對 ＰＣＯＳ 大鼠卵巢顆粒細(xì)胞

（ＧＣ）分泌功能和ＳＣＦ 基因表達(dá)產(chǎn)生的影響，現(xiàn)匯報(bào)如下。

材料與方法

１  動(dòng)物     選取８４ 只雌性 ＳＤ 大鼠，每只日齡均為２１ 日，體重為４０～５０ｇ；另選取５０只雌性ＳＤ 大鼠，每只６周齡，并且體重為１７０～１８０ｇ，所有大鼠均清潔級飼養(yǎng)，給予自然光照，控制室溫不超過２０ ℃ ～２５ ℃范圍。

２ 藥物與主要試劑 由武漢遠(yuǎn)城科技發(fā)展公司提供脫氫表雄酮（ＤＨＥＡ）；浙江田雨藥用油有限公司提供實(shí)驗(yàn)注射大豆油；滋陰方組成成分為：紫河車、熟地黃、菟絲子、當(dāng)歸、白芍以 及山茱萸等中藥；補(bǔ)陽方組成成分為：yin羊藿、黨參、補(bǔ)骨脂、巴 戟天以及川續(xù)斷等。混合以上中藥，置于水中浸泡１ｈ 后，采用武火煮沸，然后用文火煮 ２０ ｍｉｎ，將其過濾，并且重復(fù)煎 ２

次，后合并濾液，置于５５ ℃ ～６０ ℃水浴條件下濃縮。實(shí)驗(yàn)給藥量依據(jù)人鼠劑量［３］進(jìn)行換算，其中滋陰方含生藥量為 ２．４８ ｇ／ｋｇ，對于補(bǔ)陽方，則含生藥量為２．２０ｇ／ｋｇ，并將煎劑冷卻后放在４℃ 溫度下保存。

由 ＨｙＣｌｏｎｅ公司提供 ＤＭＥＭ／Ｆ１２ 培養(yǎng)基、胰蛋白酶，由 ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ 公司提供１０％ 胎牛血清；北京賽百盛生物工程公司提供ＳＣＦ 與 β－ａｃｔｉｎ 引物，上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司提供 

ＥＬＩＳＡ 試 劑 盒；Ｂｉｏ－Ｔｅｋｅ 公 司 提 供  ＲＮＡ 提 取 試 劑 盒，；

ＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑ，ＴａｋａＲａ公司；上海博升生物科技有限公司提供孕馬血清促性腺激素（ＰＭＳＧ），并由上海生物化學(xué)制藥廠提供人絨毛膜促性腺激素（ＨＣＧ）。

３ 實(shí)驗(yàn)方法

３．１  構(gòu)建實(shí)驗(yàn) ＰＣＯＳ 大鼠模型：對８４ 只雌性 ＳＤ 大鼠進(jìn)行編號，將其隨機(jī)分成模型組（ｎ＝６７）與空白對照組（ｎ＝１７）。 ８４只大鼠全部在２１ｄ 齡斷乳，實(shí)驗(yàn)開始第１ 天為適應(yīng)性喂養(yǎng)進(jìn)行２ｄ后，即在２３ｄ 齡，模型組每天需定時(shí)在其頸背部采取

皮下注射方式予以６ ｍｇ／１００ｇ 的 ＤＨＥＡ 以及０．２ ｍｌ量的注射用大豆油，并對對照組每天在頸背部采取皮下注射方式予以０．２ ｍｌ量的注射用大豆油，均持續(xù)應(yīng)用１ 月。模型組大鼠在注射第２０ｄ需要每天獲取其陰道涂片，通過陰道涂片了解到大鼠正在動(dòng)情間期，沒有動(dòng)情周期變化以及排卵現(xiàn)象；２ 組均在第 ３０ｄ進(jìn)行眼眶靜脈采血，其中模型組大鼠血清激素睪酮水平升高表示造模成功，本實(shí)驗(yàn)有７只造模失敗必須剔除。

３．２  分裂并且培養(yǎng)顆粒細(xì)胞：在第３１ 天需對每只大鼠采取頸部皮下注射方式予以 ＰＭＳＧ５０ＩＵ，并于４８ｈ 后在模型組里面以隨機(jī)原則選３０只大鼠，同時(shí)在空白對照組里面選１０ 只大鼠，將其處死之后摘取卵巢，有效分離并且培養(yǎng) ＧＣ。對于模型組與對照組之中剩余大鼠，分別為３０ 只與７ 只，均以頸部皮下注射方式給予 ＨＣＧ２５ＩＵ，并在注射后第６天將其處死，然后摘取卵巢有效分離并且培養(yǎng)卵巢部位黃素化顆粒細(xì)胞。處于無菌條件下對所取卵巢進(jìn)行分離處理，去除附近脂肪組織，放于低倍顯微鏡下采取２５ 號針頭將大鼠卵泡刺破，并且輕拍擠壓，確保卵母細(xì)胞與其顆粒細(xì)胞同時(shí)順利逸出。采用２００ 目鋼篩進(jìn)行過濾，并在離心處理后收集顆粒細(xì)胞。選用０．４％ 臺盼藍(lán)進(jìn)行染色計(jì)數(shù)，如果鏡下沒有染為藍(lán)色，說明是死細(xì)胞［４］。控制 ＧＣ 密度數(shù)值為１．０×１０５／ｍｌ，并且接種于底面積２５ｃｍ２培養(yǎng)瓶里面，其中每培養(yǎng)瓶體積為 １ ｍｌ，放 在 ３７℃ 且含 ５％ ＣＯ２ 相應(yīng)培養(yǎng)箱內(nèi)部恒溫培養(yǎng)。待大部分細(xì)胞基本貼壁之后需更換培養(yǎng)液，之后應(yīng)該每隔４８ｈ進(jìn)行１次更換。待細(xì)胞培養(yǎng)４８ｈ，需以０．１％ 胰酶消化，獲得單細(xì)胞懸液，采取磷酸緩沖液沖洗２次，并以４％ 多聚甲醛將其固定１０ ｍｉｎ。如果 ＨＥ染色顯示細(xì)胞形態(tài)完整，外觀為多角形，同時(shí)核呈深藍(lán)色，此外胞漿淡紅色伴隨許多顆粒，且是 ＧＣ，待其貼壁后備用［５］。

３．３  調(diào)配含藥血清：將所選５０ 只６ 周實(shí)驗(yàn)大鼠按照隨機(jī)原則分為補(bǔ)陽組、滋陰組以及空白對照組，采用中藥與 ０．９％ ＮａＣｌ溶液灌胃。對于灌胃給藥劑量，必須是正常大鼠劑量十倍，保證２ 次／ｄ，間隔時(shí)間為１２ｈ，控制灌胃藥總體積≤３ ｍｌ，且持續(xù)給藥３ｄ，注意第３ｄ取血樣前嚴(yán)格禁食１２ｈ，同時(shí)１ 次給予全天劑量，并于給藥１ｈ后進(jìn)行麻醉處理，再行心臟采血。離心處理血樣之后，同組血清混合，然后過濾，置于５６ ℃ 溫度下滅活，放在－２０ ℃條件存儲［６］。

３．４  分組與藥物干預(yù)：對所培養(yǎng)獲得的顆粒細(xì)胞進(jìn)行分組，共１０組，且各組樣本包括５ 個(gè)復(fù)孔。具體干預(yù)措施為：空白對照組采用原代培養(yǎng)所獲得的正常大鼠 ＧＣ；模型組１ 采用模型組大鼠 ＧＣ；滋陰方組１采用含５％ 滋陰方藥相應(yīng)血清*培養(yǎng)液，其中包含 ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１％ 三抗以及１０％ＦＣＳ；滋陰方組２采用含１０％ 滋陰方藥相應(yīng)血清*培養(yǎng)液進(jìn)行研究；滋陰方組３采用含２０％ 滋陰方藥相應(yīng)血清*培養(yǎng)液進(jìn)行研究；補(bǔ)陽方組１采用含５％ 補(bǔ)陽方藥相應(yīng)血清*培養(yǎng)液進(jìn)行研究； 補(bǔ)陽方組２采用含１０％ 補(bǔ)陽方藥相應(yīng)血清培養(yǎng)液進(jìn)行研究；補(bǔ)

ＰＣＲ 具體反應(yīng)程序完成后，利用ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓＳｏｆｔｗａｒｅ軟件自動(dòng)獲取 ＱＲ 值。以熒光定量 ＲＴ－ＰＣＲ 法［８］測定ＩＧＦ－１ 表達(dá)灰度值。

４  觀察指標(biāo)     觀察各組細(xì)胞培養(yǎng)液里面 Ｅ２ 、ＳＣＦ、Ｔ 水平、ＩＧＦ－１表達(dá)灰度值及ＳＣＦ ｍＲＮＡ 表達(dá)情況。

５  統(tǒng)計(jì)學(xué)方法     選用ＳＰＳＳ１９．０ 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析觀察指

標(biāo)數(shù)據(jù)，其中計(jì)量資料以珚ｘ±ｓ 表示，計(jì)數(shù)資料以（％）表示，分別用ｔ 值與 χ２ 值檢驗(yàn)。結(jié)果顯示 Ｐ ＜０．０５ 表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

１  對照組、模型組１與滋陰方組 ＧＣ 里面 Ｅ２ 、ＳＣＦ 水平比

較     模型組１ＧＣ 里面 Ｅ２ 水平為（２４．５３±６．０２）ｐｍｏｌ／Ｌ，明顯低于對照組（３３．５４±６．０９）ｐｍｏｌ／Ｌ（Ｐ ＜０．０５），且 ＳＣＦ 水平（２７８６．

００±９４．００）ｐｇ／ｍｌ，明顯高于對照組（２５４９．００±５８．００）ｐｇ／ｍＬ；

滋陰方組２ＳＣＦ（２４８９．００±１２７．００）ｐｇ／ｍｌ與滋陰方組 ３ＳＣＦ

（２４７３．００±１０９．００）ｐｇ／ｍＬ 均明顯低于模型組１（Ｐ ＜０．０５），而滋陰方組２Ｅ２（３３．２８±３．５７）ｐｍｏｌ／Ｌ 與滋陰方組３Ｅ２ （３３．８５±

２．３０）ｐｍｏｌ／Ｌ 均明顯高于模型組１（Ｐ＜０．０５）。

２  對照組、模型組１ 與滋陰方組大鼠 ＧＣＳＣＦ ｍＲＮＡ 表達(dá)情況、ＩＧＦ－１灰度值比較     模型組１ 大鼠 ＧＣＳＣＦ ｍＲＮＡ 表

達(dá)（１．０２±０．０３）明顯高于對照組（０．１３±０．１９）（Ｐ ＜０．０５），且

ＩＧＦ－１灰度值（１５４．９３±８．１７）明顯小于對照組（１６９．２０±２．６８）；滋陰方組２ ＧＣ ＳＣＦ ｍＲＮＡ 表達(dá)（０．２３±０．０７）與滋陰方組 ３

ＧＣＳＣＦ ｍＲＮＡ 表達(dá)（０．２０±０．１４）均顯著低于模型組１（Ｐ ＜０． ０５），滋陰方組３ＩＧＦ－１灰度值（１６７．０３±４．２６）明顯高于模型組

１（Ｐ＜０．０５）。

３ 對照組、模型組與補(bǔ)陽方組大鼠卵巢部位黃素化顆粒細(xì)胞里面Ｔ、ＳＣＦ 水平比較 模型組大鼠卵巢部位黃素化顆粒細(xì)胞里面Ｔ 為（４．８９±０．４５）ｎｇ／ｍｌ，明顯高于對照組（４．１１±０．

４７）ｎｇ／ｍｌ（Ｐ＜０．０５）；補(bǔ)陽方組２Ｔ（４．３５±０．２６）ｎｇ／ｍｌ與補(bǔ)陽方組３Ｔ（４．３２±０．２９）ｎｇ／ｍｌ明顯低于模型組（Ｐ ＜０．０５），而補(bǔ)陽方組１Ｔ 水平與模型組的比較無顯著差異（Ｐ ＞０．０５）；５ 組 ＳＣＦ 水平比較無顯著差異（Ｐ＞０．０５），見表１。

表１ 對照組、模型組與補(bǔ)陽方組大鼠卵巢部位黃素化顆粒細(xì)胞里面Ｔ、ＳＣＦ 水平比較（珚ｘ±ｓ）

  組     別 ｎ ＳＣＦ（ｐｇ／Ｌ） Ｔ（ｎｇ／ｍＬ）

陽方組

３采用含

２０％

補(bǔ)陽方藥相應(yīng)血清培養(yǎng)液進(jìn)行研究；空白

對照組采用原代培養(yǎng)所得正常大鼠卵巢部位黃素化顆粒細(xì)胞進(jìn)行研究；模型組采用模型組大鼠所得卵巢部位黃素化顆粒細(xì)胞進(jìn)行研究。

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