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恒遠實驗,一氧化氮合酶組織化學染色法的原理與過程

閱讀:614          發布時間:2014-3-26
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    一氧化氮合酶是一種連接酶,能催化前體物質L精氨酸L瓜氨酸和一氧化氮(NO)。NO是中樞和外周神經系統中的一種神經遞質,活細胞間信使和內皮源性松弛血管的介質,在神經、心血管及免疫系統中有廣泛的作用。NO極不穩定。易于擴散游離,半衰期短,不易檢測。因NOS是合成NO的關鍵酶,故通常通過檢測NOS的活性來評估NO的分布和功能。NOS有3種異構型,即神經型NOS、內皮型NOS和細胞因子誘導型NOS。由于還原型輔酶Ⅱ—黃遞酶與NOS在化學結構和組織定位上有*的一致性,且也與NO密切相關.故人們常采用NADPH-黃遞酶法來顯示NOS活性。
1、原理:在βNADPH存在下,NOS的C末端能將NADPH電子轉移到NBT,將NBT還原成不溶性藍紫色甲臘沉淀產物。
2、孵育液配制
    β—NADPH                   10mg
    NBT                        5mg
    Triton X—100              0.03ml
    0.05mol/L TB(pH 8.0)     9.97ml
    臨用前配制。
3、染色程序
    ① 固定:4%多聚甲醛(0.1mol/LPBS配制)灌流固定,取材后入同樣固定液再固定1小時(4℃),20%蔗糖中4℃放置一個晚上;
    ② 冰凍切片:厚10—401.Lm;
    ③ 孵育:切片人孵育液中37%孵育30分鐘~1小時;
    ④ 終止反應:切片人0.05mol/LTB或蒸餾水中;分鐘;
    ⑤ 常規脫水、透明、封片或直接用甘油明膠封片。
4、結果與評價
    反應產物為藍色或藍紫色沉淀。NADPH-黃遞酶法顯示NOS活性,方法簡便經濟,應用廣泛,但不能區分NOS亞型。
5、
    在孵育液
對照實驗中除去β—NADPH或用0.1mol/L N—亞硝基精氨酸(NOS抑制劑)預孵育切片1小時,結果應為陰性。

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