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胰酶消化法培養(yǎng)平滑肌細(xì)胞
1.1　試劑和動(dòng)物
胰酶購(gòu)自Sigma公司；α-actin抗體購(gòu)自上海恒遠(yuǎn)生化有限公司；PBS液各成分均為市售分析純；新生小牛血清購(gòu)自HyClone；DMEM 為Gibco產(chǎn)品。雄性Wistar大鼠（2只，體重175±25 g）購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
1.2　胰酶消化法原代培養(yǎng)
Wistar大鼠處死，迅速取出胸主動(dòng)脈，浸泡在含無(wú)菌PBS的表面皿中，轉(zhuǎn)移到無(wú)菌超凈臺(tái)。在表面皿中漂洗主動(dòng)脈去除殘留的血跡，縱向剪開(kāi)主動(dòng)脈，把主動(dòng)脈鋪平并使內(nèi)膜朝上，用鑷子來(lái)回刮除內(nèi)膜層，剝離血管中膜。將剝離的血管中膜用眼科剪剪碎，碎片大小在1 mm×1 mm左右。裝入含0.25%胰酶的玻璃培養(yǎng)瓶中于37℃條件下消化。當(dāng)在顯微鏡下觀察組織塊表面出現(xiàn)大量細(xì)胞時(shí)應(yīng)立即加入血清終止消化，一般消化的時(shí)間在 3.5 h。終止消化后將玻璃培養(yǎng)瓶置于37℃空氣搖床振搖10 min，繼續(xù)用吹打的方法使組織塊表面的細(xì)胞盡可能脫落。待細(xì)胞從組織塊脫離后，120目細(xì)胞篩過(guò)濾，轉(zhuǎn)入離心管內(nèi)離心，棄上清，用含20%小牛血清的 DMEM培養(yǎng)基吹打細(xì)胞，zui后接種于25 mL培養(yǎng)瓶，放入CO₂孵箱培養(yǎng)，48 h后換液。
1.3　傳代培養(yǎng)
細(xì)胞融合后，倒去舊的培養(yǎng)液，加入適量的0.25%胰酶，顯微鏡下觀察，見(jiàn)細(xì)胞收縮后去除消化液，加入適量培養(yǎng)液，吹打細(xì)胞，以1∶2接種于新培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)足培養(yǎng)液，放入37℃、5%CO₂孵箱培養(yǎng)。傳代細(xì)胞從第三代開(kāi)始可換用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。VSMC 至少可以傳16代以上，并且從第二代開(kāi)始平滑肌細(xì)胞即可凍存。
1.4　動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的鑒定

相差顯微鏡下，細(xì)胞未匯合之前多數(shù)呈梭形，至匯合后，部分區(qū)域細(xì)胞束狀排列，呈典型的“峰和谷”狀態(tài)。將傳代獲得的平滑肌細(xì)胞接種于蓋玻片上，3~4天后至亞匯合狀態(tài)，取出細(xì)胞爬片，PBS清洗后用4℃純丙酮固定15~30 min，自然晾干。采用小鼠抗大鼠α-肌動(dòng)蛋白抗體免疫組織化學(xué)染色鑒定VSMC肌動(dòng)蛋白。根據(jù)S-P免疫組織化學(xué)染色的常規(guī)方法，以平滑肌細(xì)胞胞漿棕黃色為陽(yáng)性結(jié)果。
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