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操作規程

一、復蘇

1、事先用Matrix進行培養皿/板的包被處理。平時Matrix保存在-20℃，使用之前放在4℃冰箱或冰上進行解凍。待Matrix解凍后，按1：100的比例迅速用PBS液體稀釋。按6孔板每孔加1ml，150px皿加2ml，250px皿加3ml的量加入，加入后迅速搖動皿/板，使加入的Matrix*覆蓋整個皿底。放到37℃培養箱中4小時，使用前去掉包被液（如果暫時不使用，用封口膜密封，在4℃冰箱能保存一周）。

2、復蘇前準備iCell解凍*培養基（iCell解凍液基礎培養基以及iCell解凍液添加劑）。加入適量的解凍液（6孔板每孔加2ml，150px皿加3ml，250px皿加9ml），另加入10ug/ml的Y27632因子，放入37℃培養箱中。

3、復蘇一支細胞用5ml的上述混合培養基，復蘇之前要在37℃水浴鍋里充分預熱。從液氮罐里取出凍存管后，迅速轉移到生物安全柜中（如果液氮罐的位置距離安全柜遠，要用裝有液氮的容器把凍存管轉移到安全柜），并用加熱好的*培養基進行解凍（用移液槍不停的往凍存管中打入—抽出培養基，交換溶解開的細胞，直至*溶解）。

4、200Xg離心5分鐘，去掉上清液，加入1ml的iCell*解凍培養基（含10ug/ml的Y27632因子），用手指彈碎管內沉淀。按接種到每孔板/皿1ml的量，補充iCell*解凍培養基到離心管中，輕輕吹吸三四次后加入培養皿/板中。水平十字振動使細胞均勻分布，5%CO2、37℃培養箱中培養24小時。

5、24小時后換成iCell*培養基（iCell基礎培養基以及iCell基礎培養基添加劑）。以后每隔22—24小時換液。細胞長滿80-90%需要傳代或凍存。

二、傳代/凍存
1、傳代前要進行培養皿/板的包被處理，做法與復蘇時相同。培養基為iCell*培養基，同時加入10ul/ml的Y27632因子。

2、傳代/凍存前，準備37℃預熱好的無鈣鎂離子PBS溶液及傳代工作液（0.5mM EDTA+0.025%胰酶）。

3、吸走iCell*培養基，并加入37℃預熱好的PBS溶液清洗二次。

4、加入適量（按6孔板每孔加1ml，150px皿加2ml，250px皿加3ml的量）的37℃預熱好的傳代工作液。

5、37℃放置4-5分鐘（前一分鐘過后拿出來，用手指輕彈幾下板/皿的底部），顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣開始脫離培養皿/板底，克隆內部大部分細胞間出現間隙但尚未相互分離，肉眼觀察到細胞集落變得不透明且發白，表明細胞消化時間理想。

6、迅速吸去傳代液，加入適量的iCell*培養基終止消化，用移液器扇形吹打皿/板底部（吹打不用超過10次），使附著的細胞集落脫落。（如果消化時間不當，致使細胞*從皿/板底剝離的情況，不用吸出傳代液，加入同等量的iCell*培養基終止消化）。

7、移入離心管，離心后重懸。傳代比例為1：8—1：12；凍存按6孔板每孔凍1支，150px皿凍2-4支，250px皿凍6-12支。每支加入0.8ml的90%iCell*培養基與10%的DMSO。

8、復蘇時按凍存前的1：4—1：6的比例進行。

注意事項
1、每次換液時要觀察細胞生長狀況以及細胞形態的變化并對細胞進行拍照，但是在培養箱外操作的時間不要過長，避免因溫度對細胞生長狀態造成不利影響。

2、更換培養基之前，要對新的培養基進行37℃預熱。為了避免反復加熱培養基而造成的培養基中各種成分的影響，只對本次要更換的量進行預熱處理。

3、用移液器吹打細胞，因為移液管的端部較為圓滑，對細胞傷害的程度小于用1ml的槍。

4、細胞密度達到80-90%時要及時傳代，否則會造成細胞形態的變化。但是，如果細胞在鋪板時混合不均勻，而形成部分集落過大的情況，即使沒有達到80-90%也要進行傳代。

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