呼吸道合胞病檢測(cè)試劑盒（酶聯(lián)免疫法）

1、實(shí)驗(yàn)原理

此酶免試劑盒可用于人血清中抗RSV（呼吸道合胞病毒）IgM抗體的體外定性和定量檢測(cè)。

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2、前言說(shuō)明

在患有細(xì)支氣管炎或肺炎的六個(gè)月大的嬰兒中，可發(fā)現(xiàn)呼吸道RSV感染和特定的臨床癥狀之間有明顯的。在年齡稍大 的嬰兒和小兒中，感染癥狀會(huì)溫和一些。 25%以上的RSV呼吸道感染都是可被察覺(jué)的。由于RSV再次感染的可能性，人們認(rèn)為這些再次感染的抗體與成年人中這些疾病的緩慢發(fā)展過(guò)程（類似于感冒） 有關(guān)。然而，特別是早年，血清抗體并不能成為抗呼吸道感染的有效保護(hù)。因此，這種病原體可能會(huì)引起細(xì)支氣管炎或引起四歲大的嬰兒患肺炎。基于呼吸道合胞病 毒抗原的關(guān)系，我們可以將呼吸道合胞病毒分為兩大類（A和B）。病毒的表面糖蛋白（G糖蛋白和融合糖蛋白）可產(chǎn)生病毒抑制抗體。RSV的A和B類病毒的G 糖蛋白與F糖蛋白相比明顯不同。用于RSV血清學(xué)診斷的補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果不是很理想。用于RSV感染的血清學(xué)診斷的酶免檢測(cè)具有很高的診斷價(jià)值，因?yàn)?酶免檢測(cè)靈敏度很高，并且可區(qū)分不同抗原的免疫球蛋白。在RSV感染中，IgM抗體反應(yīng)可能不會(huì)出現(xiàn)或很弱，以至于不能獲得可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在一急性感染 中，因?yàn)镮gA抗體可能會(huì)持續(xù)幾個(gè)月或幾年，所以單一樣品中的IgG抗體檢測(cè)并不明顯。被推薦為急性RSV感染血清學(xué)檢測(cè)方法是檢測(cè)血清中的IgG抗體 （雙份，要求其濃度明顯提高了）。健侖生物

3、實(shí)驗(yàn)原理

此固相ELISA試劑盒利用的夾心法原理。包被板上包被了抗原。用對(duì)人IgM具有特異性的酶標(biāo)二抗來(lái)檢測(cè)結(jié)合到包被抗原的樣品特異性抗體。底物反應(yīng)后，所顯示的顏色強(qiáng)度與檢測(cè)到的IgM特異性抗體的量成正比。樣品的結(jié)果可直接使用標(biāo)準(zhǔn)曲線得。健侖生物

4、試劑盒組成：

5、實(shí)驗(yàn)所需材料但試劑盒不提供

1）        RF吸附劑

2）        移液器，體積：5；50；100；500 µL

3）        校準(zhǔn)儀

4）        樣品稀釋用試管（1ml）

5）        帶試劑儲(chǔ)器8道移液器

6）        洗滌瓶，自動(dòng)或半自動(dòng)洗板機(jī)

7）        能在450nm處讀數(shù)的酶標(biāo)儀

8）        雙蒸水或去離子水

9）        吸水紙，取樣吸頭和計(jì)時(shí)器

6、實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備說(shuō)明

6.1成分準(zhǔn)備

6.2樣品稀釋

樣品中IgM濃度高于zui高標(biāo)準(zhǔn)品的應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步稀釋。健侖生物

6.3用RF吸附劑處理：

為了避免吸附特異性抗體，應(yīng)當(dāng)避免溫育時(shí)間﹥15min。

預(yù)處理的樣品可能會(huì)是渾濁的。

7、實(shí)驗(yàn)步驟：

1）        加100µL標(biāo)準(zhǔn)品和已稀釋樣本于相應(yīng)反應(yīng)孔中，在定性檢測(cè)中只使用標(biāo)準(zhǔn)品B。

2）        封板后室溫（18℃-25℃）溫育60分鐘。

3）        移去粘性金屬板，棄去孔中液體。用300µL洗滌液洗板3次，在吸水紙上拍干。

4）        在每一微孔中加入100µL酶聯(lián)物。

5）        封板后室溫（18℃-25℃）溫育30分鐘。

6）        移去粘性金屬板，棄去孔中液體。用300µL洗滌液洗板3次，在吸水紙上拍干。加底物液和終止液時(shí)，如果有條件的話，可使用8孔微量移液器。確保底物液和終止液都是相同的時(shí)間間隔加入。使用確切容積并避免氣泡產(chǎn)生。

7）        每孔加TMB底物液100µL。

8）        室溫（18℃-25℃）避光溫育20分鐘。

9）        在每一微孔中加入100µLTMB終止液以終止底物反應(yīng)。輕輕搖動(dòng)包被板以使試劑混合均勻。此時(shí)，顏色藍(lán)色變成黃色。

10）     加終止液后60分鐘內(nèi)在450nm處測(cè)OD值。

8、結(jié)果計(jì)算

在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上或用自動(dòng)生成的方法，以標(biāo)準(zhǔn)品的OD值為Y軸，濃度為X軸，繪制一標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。用立體圖、4參數(shù)對(duì) 數(shù)圖或?qū)?shù)-對(duì)數(shù)圖都可獲得良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，用標(biāo)準(zhǔn)品的每一單值進(jìn)行計(jì)算（樣品結(jié)果明顯異常的值必須刪除掉，應(yīng)使用更加合理的單值）。樣 品的濃度可直接從標(biāo)準(zhǔn)曲線上獲得。一旦樣品稀釋了，就應(yīng)當(dāng)乘以相應(yīng)的稀釋因子。如果樣品所測(cè)得的濃度高于zui高標(biāo)準(zhǔn)，則應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備說(shuō)明所述對(duì)樣品進(jìn) 行稀釋，并重新檢測(cè)。

9、結(jié)果判定： ＞12 U/ml  為陽(yáng)性,8 - 12 U/ml  為可疑,＜ 8 U/ml  為陰性

此檢測(cè)結(jié)果并不是任何治療結(jié)果判定的*因素，它應(yīng)當(dāng)結(jié)合臨床觀察和診斷結(jié)果加以判斷。

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