端粒酶活性檢測實驗

端粒酶(Telomerase)是由RNA和蛋白質組成的一種核糖核蛋白酶。人端粒酶RNA組分(hTR)于1995年被克隆，其中含有端粒重復序列的模板(5'-CUAACCCUAAC-3');蛋白質組分具有RNA依賴的DNA多聚酶活性，結構尚不清楚。端粒酶能以自身RNA的模板區為模板復制合成端粒序列。在胚性細胞等增殖活躍的細胞中具有端粒酶活性,而在正常成熟體細胞中端粒酶失活，同時還發現絕大多數腫瘤細胞都呈端粒酶陽性，而在癌旁組織和正常組織陽性率很低，推測端粒酶可能是一個廣 泛的腫瘤標志物。因此近幾年端粒酶在各種腫瘤中的研究日益深入，同時促進了檢測方法的改進與完善。本文對其檢測方法綜述如下。

1基本原理

  端粒酶在體外可以以其自身RNA的模板區為模板，在適宜的寡核苷酸鏈的末端添加6個堿基的重復序列，用聚丙烯酰胺(PAGE)凝膠電泳可顯示6個堿基差異的梯帶。1994年Kim建立 了基于PCR基礎上的端粒重復序列擴增法(telomeric repeat amplification protocol, TRAP)。TRAP反應原理見下圖。

首先合成一個18nt的TS做 上游引物，端粒酶結合TS末端的GTT并合成ggtag，然后每經過一-次轉位合成一個gttag的6堿基重復序列，端粒酶滅活后，加入-個24nt的CX做下游引物，經過多次變性退火延伸，擴增端粒酶延伸產物。

2基本技術方法

2.1標本來源術摘除組織，針吸活檢組織，胸水，腹水，膀胱或胰管沖洗液，棉拭子所取分泌物和尿液(尚有爭議)等。

2.2端粒酶的提取方法早期采用超聲等物理破碎的方法在不同細胞中的提取效率差異較大，此后采用去污劑(如CHAPS)裂解的方法在少量細胞獲取了較穩定的端粒酶提取液。現詳述如下: 40 ~ 100mg冷凍(-70%°C)組織或104 ~ 106沉淀細胞用冰預冷的洗液[10mM hepes-KOH(pH7 .5), 1.5mM MgCI2, 10mM KCI,1Mm DTT]洗1次，10000g4°C離心1min， 沉淀加200μ冷裂解液[10mM tris-HCl(Ph7 .5), 1mMMgC12,1mM EGTA, 0.1mM PMSF, 5mM β-巰基乙醇，0.5%CHAPS, 10%甘油，自動勻漿器冰浴中勻漿，450rpm,25min, 16000g49C離心20min,移取上清160μI,部分樣品用于蛋白定量，其余迅速冷凍，-70°C保存。端粒酶經小于10次凍融可保持活性穩定。部分學者對某些標本用05%Tween-20代替0.5%CHAPS獲得更好的效果。

2.3 TRAP擴增50μITRAP體系包含20mM tris-HCl(pH8.3), 1.5mM MgCI, 63mM, KCI, 0.005%Tween-20，1mM EGTA, 50μMdNTP, 0.1ug tS, 1μg T4基因32蛋白，0. 1mg/ml牛血清白蛋白，1 ~ 2μICHAPS細胞提取液(含6μg)蛋白，0.2 ~ 0.4u[a-32P]dGIP或[a-32P]dGIP(10μCiμl, 3000Ci/mmol),這一-反應體系可同時滿足端粒酶Tap聚合酶的活性需要，239C10min合成端粒酶延伸產物后，949C3s滅活端粒酶，加入0.1μg cX和2U Taq酶，94°C30s, 50°C30s， 72°C1 .5min擴增27個循環，25μ爐 物進行15%PAGE凝膠電泳。

2.4引物設計為了防止上、下游引物之間的結合，在CX引物上設計了3個不匹配堿基(見圖1處),單鏈結合蛋白T4基因32蛋白可進一步避免引物之 間的結合，TS和CX引物被廣為采用，在上述條件下，只有延伸了三至更多的GGTTAG片斷才有特異擴增，即得到從40bp開始的6bp差異的梯帶。Broccol等以5'-GGCGCG(ACCCTA)3-3'代替CX引物，由于增加了G-C含量，可提高退火溫度，進一步避免引物間的結臺，增加特異性。Oncor公司設計RP引物代替CX引物，得到從50bp開始的6bp差 異的梯帶。

3擴增片斷的檢測

3.1同位素法Kim建立的方法即為同位素法，其應用多。采用[a-32P]dGTP或dCTP摻入的報道很多，但部分學者用[y-32P]dATP和T 4激酶標記TS引物的5端，發現更易于檢出低水平的端粒酶，同時更易定量。PAGE凝膠電泳后在X-光片上放射自顯影或用Phosphoimager儀掃描測定3h。同位素法的優點是靈敏度高，100個永生化細胞27個循環即可檢出，缺點是存在放射性污染，且放射自顯影需8h至兩天以上時間，時間較長。

3.2染色法電泳后用SYBR green或EB染色，然后紫外燈下觀察或用CCD圖像系統測定。EB在302nm紫外透射儀和桔紅色紫外濾光片下效果hao，可得與SYBR green相近的敏感性。染色法簡便，快速，靈敏度為100個永生化細胞30個循環，由于染色帶的信號強度不能精*&確反映其分子數(大片斷染色更強)，因此染色法只能判定相對端粒酶活性，而不能測定端粒酶延伸產物的確切數量。

3.3熒光法加入10pmo熒光素標記(如FAM，FITC)的TS和/或CX引物擴 增，經8%的變性PAGE凝膠電泳，DNA測序儀自動讀取數值，片斷管理系統軟件自動計算掃描曲線的峰高和峰面積，從上樣到出結果僅需90min。熒光系統極敏感，為避免過量擴增產物可能給出不可靠結果，要使用0.5~ 1.0μg的低蛋白量,擴增27個循環，由于片斷管理系統能自動檢出很微弱的熒光，因此不能精*&確測定低水平端粒酶活性[8 ~11]。熒光法的另一-應用是于原位一-TRAP分析， 可以在細胞水平.上檢出端粒酶活性，因此可以判定是哪些細胞、多少細胞具有端粒酶活性，而裂解提取法不能知其活性的細胞來源。原位分析在硅化玻片上進行，熒光顯微鏡下觀察結果。目前只用于新鮮標本，用凍存病理標本的實驗尚不成功，需改進方法防止凍融中

胞內端粒酶的分散及增加標本的滲透性等。

3.4 ELISA法TS弓|物5'端標以生物素，PCR擴增后，將產物變性，加入異羥基洋地黃毒苷標記的可與擴增產物的重復片斷特異結合的探針，雜交產物上的生物素與固定在微孔板上的卵白素相結合，而探針上的異羥基洋地黃毒苷與過氧化物酶標記的抗異羥基洋地黃毒苷抗體結合，然后加入底物，顯色后用酶標儀測定。

ELISA法是寶靈曼試劑盒使用的方法，由于沒有電泳，因此觀察不到6bp差異的梯帶。

4質量控制

4.1排除假陽性設置以下四種對照(1)85°C10min滅活端粒酶; (2)端粒酶對RN ase敏感，0. 5μg/10μ提取液+1ugRNase, 37°C, 20min; (3)不加提取液; (4)不加CX或TS引物。以上實驗可排除引物二聚體或PCR污染。

4.2排除假陰性

(1)以陽性細胞沉淀(106細胞)的裂解提取液為陽性對照進行TRAP分析可以排除由于試劑質量不好造成的假陰性。

(2)組織提取液中Taq酶抑制物的存在會造成假陰性，為此Wright等加入一個150bp的內標準。內標準的獲得方法如下:設計TS加長引物: 5'-AATCCGTCGAGCAGAGTTGTGAATGAGGCCTTC-3和CX加長引物: 5'-(CCCTTA)3CCCTAATAGGCGCTCAATGTA-3',分別在TS和CX引物的3端增加15個堿基，可與編碼鼠肌蛋白的97 ~ 132位氨基酸的堿基匹配，擴增后得到150bp產物，柱純化后備用。每個TRAP反 應加入15ag內標為模板，TS和CX引|物既可擴增端粒酶延伸產物，又可擴增150bp的內標，當無150bp擴增帶出現時說明存在Taq酶抑制劑，這對內標為眾多學者所采用。也有其它學者采用200bp或36bp的內標[4.8,14]。

(3)稀釋提取液可降低酶抑制物濃度，擴增帶從無到有說明含酶抑制物。為了減少甚至排除某些標本中存在的抑制物的影響，許多學者在得到端粒酶延伸產物后進行酚一氯訪異戊醇(25.24:1)抽提,酒精沉淀純化。

5端粒酶活性的半定量檢測

由于端粒酶活性在少數正常組織細胞中有微弱的表達，而且與細胞的增殖活躍程度、腫瘤的惡變程度及預后等有關，因此半定量測定端粒酶活性在臨床應用上意義重大。簡便的方法是通過10倍稀釋提取液以有無6bp差異的梯帶產物為標準。在任何稀釋度下無產物為(-);不稀釋下有產物為(+); 10倍稀釋下有產物為(++); 100倍稀釋 下有產物為(+++),還可再進行1000倍稀釋。 Wright等將內標引入后使端粒酶活性的半定量檢測成為可能，將6bp差異的梯帶強度總和和除以內標的強度進行標準化后，在10 ~ 11000個細胞間具有很好的線性關系，而無內標時在大于300個細胞即進)平臺。許多學者采用這種方法描述相對端粒酶活性。Oncor試劑盒(1996年第 2版)提供了更為準確的方法，用Phosphoimager儀掃描測定凝膠信號，

TPG(Total product Generated,總生成產物)單位((x-0)/)((-0)/C)x100(TSR8為0.1amol), 其中x代表無熱滅活處理標本管中梯帶信號總和; x0代表熱滅活管信號; r代表T SR8質控管梯帶信號總和，TSR8是人工合成的寡核苷酸鏈，由于TS連接AG(GGTTAG)7構成; r0代表無標本的裂解液對照管信號; c和cR分別代表無熱滅活處理標本管和TSR8質控管中內對照的信號，每個TPG單位相當于1x10- 3amol或600個TS引物分子30°C，10min延伸至少4個端粒重復序列的數量，在1 ~ 300TPG(相當于約30 ~ 10000個陽性對照細胞中所含端粒酶活性)范圍內成線性。

6總結

綜上所述，Kim建立的同位素法靈敏度高應用多，但是存在放射性污染且時間較長，染色法操作簡便時間短，不過只能檢測相對端粒酶活性，熒光法只用于新鮮樣本，在日常的應用中大家可根據具體情況選擇不同方法或對其進行簡單的組合操作。

實驗代做服務：