Na⁺K⁺- ATP酶活性測定說明書（分光光度法）

貨號：YJ2218

規(guī)格：100管/48樣

產(chǎn)品簡介：

Na⁺K⁺- ATP酶廣泛分布于植物、動(dòng)物、微生物和細(xì)胞中，可催化ATP水解生成ADP和無機(jī)磷。

Na⁺K⁺-ATP酶分解ATP生成ADP及無機(jī)磷，通過測定無機(jī)磷的量來確定ATP酶活性。

自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)、水浴鍋、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板跑、研缽、冰和蒸餾水。

產(chǎn)品內(nèi)容：

提取液：液體100mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：液體 10mL×1 瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1瓶，-20℃保存；臨用前加入6ml蒸餾水充分混勻待用；用不完的4℃保存一周。

試劑三：液體 2ml×1 瓶，4℃保存。

試劑四：粉劑×1瓶，4℃保存。用時(shí)加入3mL蒸餾水4℃保存。

試劑五：粉劑×1 瓶，4℃保存。用時(shí)加入25ml蒸餾水，溶解后4℃保存一周。

試劑六：粉劑×1 瓶，4℃保存。用時(shí)加入25ml蒸餾水，溶解后4℃保存一周。

試劑七液體25ml×1瓶，室溫保存。

試劑八：10mmol/L 標(biāo)準(zhǔn)磷貯備液 10mL×1 瓶，4℃保存。

0.5μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液配制：將試劑八 20倍稀釋，即取 0.1mL試劑八加1.9mL蒸餾水充分混勻。

定磷劑的配制：按H2O:試劑五:試劑六:試劑七=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷劑應(yīng)為淺黃色。若無色則試劑失效，若是藍(lán)色則為磷污染，定磷劑現(xiàn)用現(xiàn)配。

注意：配試劑建議用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。

樣品酶液的制備：

1. 細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照每500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（功率20％，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

組織：稱取約0.1g組織，加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

1. 血清（漿）樣品：直接檢測。

操作步驟：

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至660nm，蒸餾水調(diào)零。
2. 酶促反應(yīng)（在EP管中加入下列試劑）

混勻，37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其他物種）準(zhǔn)確水浴10min

混勻，8000g，常溫離心10min，取上清液

1. 定磷(在EP管或96孔板中依次加入下列試劑)

混勻，室溫放置30min，在 660nm處，記錄各管吸光值。

注意：

1. 由于每一個(gè)樣都必須做對照，本試劑盒100管保證測48份Na⁺K⁺-ATP酶。
2. 此法具有微量、靈敏、快速的特點(diǎn)。所以對測定所用試管要求嚴(yán)格無磷。
3. 空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只要做一管。

計(jì)算：

1. 血清（漿）Na⁺K⁺- ATPase活力的計(jì)算:

定義：規(guī)定每小時(shí)每毫升血清（漿）中Na⁺K⁺- ATP 酶分解ATP 產(chǎn)生1μmol無機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。

Na⁺K⁺-ATP酶活力（U/mL）= （C標(biāo)準(zhǔn)管×V總）×（A測定管-A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷V樣÷T

=7.5×（A測定管-A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）

1. 組織、細(xì)菌或細(xì)胞中Na⁺K⁺- ATPase活力的計(jì)算：

1. 按蛋白濃度計(jì)算：

定義：規(guī)定每小時(shí)每毫克組織蛋白中Na⁺K⁺- ATP 酶分解ATP 產(chǎn)生1μmol無機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。

Na⁺K⁺-ATP酶活力(U/mg)= C標(biāo)準(zhǔn)管×（A測定管-A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）×V總÷（Cpr×V樣）÷T =7.5×（A測定管-A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷Cpr

1. 按樣本鮮重計(jì)算：

定義：規(guī)定每小時(shí)每克組織中Na⁺K⁺-ATP 酶分解ATP 產(chǎn)生1μmol無機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。

Na⁺K⁺-ATP酶活力(U/g)= C標(biāo)準(zhǔn)管×（A測定管-A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）×V總÷(V樣÷V樣總×W)÷T=7.5×（A測定管-A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷W

1. 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

定義：規(guī)定每小時(shí)每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞中Na⁺K⁺-ATP 酶分解ATP 產(chǎn)生1μmol無機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。

Na⁺K⁺-ATP酶活力(U/10⁴)= C標(biāo)準(zhǔn)管×（A測定管-A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）×V總÷(V樣÷V樣總×500)÷T=0.015×（A測定管-A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）

C標(biāo)準(zhǔn)管：標(biāo)準(zhǔn)管濃度，0.5μmol/mL；V總：酶促反應(yīng)總體積，0.25mL；V樣：加入樣本體積，0.1mL ；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1/6小時(shí)；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。

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