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Ca++ Mg++-ATP 酶活性測定(微量法)說明書

時間:2019/2/26閱讀:1919
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貨號:YJ1174                                     規格:100管/48樣

Ca++ Mg++-ATP 酶活性測定說明書

微量法

正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義:

Ca++ Mg++-ATP 酶廣泛分布于植物、動物、微生物和細胞中,可催化ATP水解生成ADP和無機磷。

測定原理:

根據Ca++ Mg++ -ATP 酶分解ATP生成ADP及無機磷,通過測定無機磷的量來確定ATP酶活性高低。

需自備的儀器及用品:

可見分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制:

提取液:液體 100mL×1 瓶,4℃保存。

試劑一:液體 10mL×1 瓶,4℃保存。

試劑二:粉劑×1 瓶,-20℃保存;臨用前加入6mL蒸餾水充分混勻待用;用不完的試劑 4℃保存一周;

試劑三:液體 2mL×1 瓶,4℃保存。

試劑四:粉劑×1 瓶,4℃保存。用時加入3mL蒸餾水, 4℃保存。

試劑五:粉劑×1 瓶, 4℃保存。用時加入25mL蒸餾水,溶解后 4℃保存一周。

試劑六:粉劑×1 瓶, 4℃保存。用時加入25mL蒸餾水,溶解后 4℃保存一周。

試劑七:液體25mL×1 瓶,室溫保存。

試劑八:10mmol/L 標準磷貯備液 10mL×1 瓶,4℃保存。

0.5μmol/mL標準磷應用液配制:將試劑八20倍稀釋,即取0.1mL試劑八加1.9mL蒸餾水充分混勻。

定磷劑的配制:按 H2O: 試劑五:試劑六:試劑七=2:1:1:1 的比例配制,配好的定磷劑應為淺黃色。若無色則試劑失效,若是藍色則為磷污染,定磷劑現用現配。

注意:配試劑建議用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器,也可以用一次性塑料器皿,避免磷污染。

樣品酶液的制備:

1、細菌、細胞或組織樣品的制備:

細菌或培養細胞:先收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細菌或細胞數量(104個):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率 20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復30次);8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。

組織:按照組織質量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。

2、血清(漿)樣品:直接檢測。

操作步驟:

1、分光光度計或酶標儀預熱 30min 以上,調節波長至 660nm,蒸餾水調零。

2、酶促反應(在 EP 管中加入下列試劑)

 

對照管

測定管

試劑一(μL)

65

45

試劑二(μL)

60

60

試劑三(μL)

 

20

樣本 (μL)

 

100

混勻,37℃(哺乳動物)或 25℃(其他物種)準確水浴 10min

試劑四(μL)

25

25

樣本 (μL)

100

 

混勻,8000g,25℃離心 10min,取上清液

3、定磷(在 EP 管或 96 孔板中加入下列試劑)

 

空白管

標準管

對照管

測定管

0.5μmol/ml標準磷應用液(μL)

 

20

 

 

上清液(μL)

 

 

20

20

蒸餾水(μL)

20

 

 

 

定磷試劑(μL)

200

200

200

200

混勻,室溫放置30min,在660nm處,記錄各管吸光值。

注意事項:

1、由于每一個樣都必須做對照,本試劑盒100管只能測48份 Ca++ Mg++-ATP酶。

2、此法具有微量、靈敏、快速的特點。所以對測定所用試管要求嚴格無磷。避免磷污染是

檢測成敗的關鍵。

3、空白管和標準管只要做一管。

Ca++ Mg++-ATPase 活力的計算:

1、血清(漿)Ca++ Mg++-ATPase 活力的計算:

定義:每小時每毫升血清(漿)中Ca++ Mg++-ATP酶分解ATP產1μmol無機磷的量為一個酶活力單位。

Ca++ Mg++-ATP 酶活力(μmol/h/mL)= [C 標準管×V 總]×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標準管-A 空白管)÷V 樣÷T=7.5×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標準管-A 空白管)

2、組織、細菌或細胞中Ca++ Mg++-ATPase 活力的計算:

(1)按蛋白濃度計算:

定義:每小時每毫克組織蛋白中Ca++ Mg++-ATP酶分解ATP產生1μmol無機磷的量為一個酶活力單位。

Ca++ Mg++-ATP酶活力(μmol/h/mg prot)= [C標準管×V總]×(A測定管-A對照管)÷(A 標準管-A空白管)÷(V樣×Cpr)÷T =7.5×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管)÷Cpr

(2)按樣本鮮重計算:

定義:每小時每克組織中Ca++ Mg++-ATP酶分解ATP產生1μmol無機磷的量為一個酶活力

單位。

Ca++ Mg++-ATP酶活力(μmol/h/g 鮮重)=[C標準管×V總]×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管)÷(W× V樣÷V樣總)÷T=7.5×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管)÷W

(3)按細菌或細胞密度計算:

定義:每小時每1萬個細菌或細胞中Ca++ Mg++-ATP酶分解ATP產生1μmol無機磷的量為一個酶活力單位。

Ca++ Mg++-ATP酶活力(μmol/h /104cell)= [C標準管×V總]×(A測定管-A對照管)÷(A 標準管-A空白管)÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.015×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管)

C 標準管:標準管濃度,0.5μmol/mL;V 總:酶促反應總體積,0.25mL;V 樣:加入樣本體

積,0.1mL ;V 樣總:加入提取液體積,1mL;T:反應時間,1/6 小時;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本鮮重,g;500:細菌或細胞總數,500 萬。

 

 

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