大腸桿菌的分離鑒定與耐藥性分析

• 細(xì)菌分離純化：無(wú)菌采集肝臟劃線(xiàn)接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，伊美蘭瓊脂培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)12-24h，用普通培養(yǎng)基進(jìn)行純化培養(yǎng)；
• 細(xì)菌形態(tài)特征：無(wú)菌挑去上述純化培養(yǎng)菌，革蘭氏染色鏡檢

電鏡觀(guān)察：FQ-180菌液培養(yǎng)7h后，3000r/min離心5min，棄上清，ddH₂O洗滌2次重懸，取15ul滴在Formver膜覆蓋在銅網(wǎng)上，2min后滴加磷鎢酸負(fù)染2min，待銅網(wǎng)烘干后，在投射電子顯微鏡下觀(guān)察

• 生化試驗(yàn)：將初步分離到的可疑菌落進(jìn)行吲哚試驗(yàn)，MR試驗(yàn)，VP試驗(yàn)，淀粉E試驗(yàn)，枸櫞酸鈉利用試驗(yàn)，乳糖、麥芽糖、蔗糖、木糖、葡萄糖、甘露糖、甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)，產(chǎn)硫化氫試驗(yàn)，尿素酶試驗(yàn)，觸酶試驗(yàn)，運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)，三塘鐵斜面穿刺試驗(yàn)（或用ATB全自動(dòng)生化鑒定系統(tǒng)和ID32E腸道菌鑒定試劑條進(jìn)行生化試驗(yàn)）
• 藥敏試驗(yàn)：按照美國(guó)臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（NCCLS）推薦的標(biāo)準(zhǔn)K-B紙片法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作和結(jié)果判斷（所采用的抗生素見(jiàn)圖1）
• 血清型鑒定：采用玻板凝集反應(yīng)對(duì)分離株進(jìn)行血清型鑒定，先用多因子血清通過(guò)玻板凝集試驗(yàn)篩選可能的血清型，然后再與大腸桿菌單因子血清各10ul在玻板上混勻，30S內(nèi)出現(xiàn)明顯凝集者為陽(yáng)性反應(yīng)，同時(shí)以菌液與0.5%碳酸生理鹽水混合物作對(duì)照，觀(guān)察有無(wú)自凝現(xiàn)象
• PCR鑒定：將分離純化后的菌株按照煮沸法制備細(xì)菌DNA模板，以大腸桿菌phoA基因的特異性引物進(jìn)行PCR鑒定
• 毒力基因與耐藥性的關(guān)系：根據(jù)藥敏試驗(yàn)的結(jié)果，針對(duì)藥敏性較為普遍的抗生素的耐藥基因情況，找出其規(guī)律，并研究獨(dú)立基因與耐藥性的關(guān)系，然后采用多重PCR方法檢測(cè)耐藥基因，如4種氨基糖苷類(lèi)耐藥基因aadA1，aac2，aac4，aphA3；3種四環(huán)素類(lèi)耐藥性基因tetA，tetC以及tetM的流行情況
• 提取DNA及16s rDNA鑒定：提取細(xì)菌基因組DNA，并使用16s rRNA Bacterial Identification PCR kit的特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，后進(jìn)一步對(duì)PCR擴(kuò)增的DNA克隆、測(cè)序并開(kāi)展序列分析
• 致病性試驗(yàn)：參照A.E.Williams等方法，設(shè)置16組試驗(yàn)組，1組陰性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)組每株菌攻毒4只小組，按0.2ul/只腹腔注射菌液濃度為1*10⁹ef/ml，對(duì)照組4只小鼠注射等劑量的生理鹽水，觀(guān)察發(fā)病及死亡情況，無(wú)菌采集死亡小鼠肝臟、心臟進(jìn)行分離鑒定
• 雞胚致死試驗(yàn)：將待測(cè)大腸桿菌分別劃板，挑去平板上的單菌落，與LB液體培養(yǎng)基中37度搖床過(guò)夜培養(yǎng)，然后離心，經(jīng)PBS洗2次，并用PBS懸液進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)?.1ml稀釋液經(jīng)尿囊腔接種12日齡SPF雞胚大約100-300CFU/只，每組10只，同時(shí)取0.1ml稀釋液涂板，做細(xì)菌計(jì)數(shù)，對(duì)照分兩組，一組直射PBS，一組不注射，計(jì)每日死亡數(shù)，質(zhì)4d，計(jì)胚胎致死率
• 病毒分離：收集病樣加入青霉素（終濃度1000U/ml）和鏈霉素（終濃度1000U/ml），于4℃作用4h以上，取0.2ul接種于9-10日齡雞胚羊膜腔，37℃培養(yǎng)72h，4℃過(guò)夜后收集羊水，每份樣品接種3枚雞胚，采集的羊水用1%雞紅細(xì)胞進(jìn)行血凝試驗(yàn)，判斷病毒是否成功分離，如果標(biāo)本呈陽(yáng)性，采用血凝抑制試驗(yàn)進(jìn)一步堅(jiān)定，標(biāo)本呈陰性則繼續(xù)自傳3代