5.3
皮膚的凍干
凍干皮膚在醫(yī)學(xué)上的臨床應(yīng)用研究始于20世紀(jì)50年代。動(dòng)物皮膚的凍干目的是用于對(duì)藥物經(jīng)皮膚滲透性的研究。由于透皮吸收給藥新型的問(wèn)世，藥物經(jīng)皮滲透性的研究正成為開(kāi)發(fā)這類(lèi)新型篩選藥物的重要手段，由于大量長(zhǎng)時(shí)間動(dòng)物皮的需求，實(shí)際應(yīng)用時(shí)常將待用皮放在冰箱里，可保存1周左右。時(shí)間再長(zhǎng)，不但影響藥理實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性，而且皮膚將變質(zhì)。為增長(zhǎng)皮膚保存期，可將動(dòng)物皮膚凍干保存；人類(lèi)皮膚凍干的目的是用于再植，為燒傷或外傷皮膚的病人植皮。
5.3.1 大鼠皮膚凍干工藝及藥物滲透性實(shí)驗(yàn)
東北大學(xué)的鄭文利博士早在20世紀(jì)末就進(jìn)行了大鼠皮膚凍干的實(shí)驗(yàn)研究。取活大鼠脫頸處死后，立即用電動(dòng)去毛刀去其腹部鼠毛，剝離皮膚，除去皮下脂肪層、血管及殘留物，用蒸餾水沖洗干凈，制成不同尺寸的皮片，再用生理鹽水沖洗數(shù)次備用。將制備好的大鼠皮放在速率降溫儀中，以-5℃/min、-l5℃/min、-30℃/min三種不同速率降溫至-30℃。將三種不同降溫速率預(yù)凍的大鼠皮，分別放入小型凍干機(jī)中抽真空，30min后壓力穩(wěn)定在120Pa,不主動(dòng)加熱，連續(xù)干燥34h后關(guān)機(jī)，充氮?dú)夂笕〕觯脽o(wú)菌塑料袋封裝后，放在干燥器內(nèi)保存。
將以不同預(yù)凍速率凍干的大鼠皮膚，經(jīng)10%福爾馬林固定，石蠟包埋制片，進(jìn)行病理切片，切片厚度4～5μm,HE染色，再顯微鏡觀察。新鮮大鼠皮組織切片如圖5-8所示，以5℃/min速率預(yù)凍并凍干大鼠皮組織切片如圖5-9所示。從圖中可以看出凍干皮組織與新鮮皮組織相本相同，未見(jiàn)細(xì)胞破裂、上皮脫離、組織褶皺、細(xì)胞變性和細(xì)胞間隙增寬等異常，說(shuō)明凍干皮組織結(jié)構(gòu)未發(fā)生變化。其他速率預(yù)凍并凍干后的結(jié)果基本一致。
凍干大鼠皮角質(zhì)細(xì)胞間隙脂流動(dòng)性的電子自旋共振(ESR)測(cè)定：選 用5-噁唑氮氧自由基硬質(zhì)酸(5-DSA)作為自旋轉(zhuǎn)標(biāo)記物，將新鮮的和 三種不同預(yù)凍速率的凍干大鼠皮角質(zhì)層樣品泡在濃度為1×10-4mol/L 的5-DSA緩沖液(pH=7.4)中12h，保溫20℃，然后取出淋洗干凈，37℃烘箱干燥1h，分別放進(jìn)電子自旋共振波譜儀樣品管內(nèi)，再置于腔中。ESR測(cè)定條件：掃描寬度200G，接收增益3.2×104，時(shí)間常數(shù)20.48ms，微波功率5.02mW，掃描時(shí)間83.888s，調(diào)制頻率 25.000kHz，調(diào)制幅度0.947G。經(jīng)ESR波譜分析得知，三種不同凍 結(jié)速率預(yù)凍的凍干大鼠皮與新鮮大鼠皮各系數(shù)相比無(wú)顯著差異，說(shuō)明 凍干大鼠皮膚未引起表皮細(xì)胞間脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，大鼠表皮角質(zhì)細(xì)胞 間脂質(zhì)排列的有序性沒(méi)有改變，流動(dòng)性沒(méi)有增加。
實(shí)驗(yàn)采用尼莫地平為模型藥物（一種腦血管擴(kuò)張藥），選用預(yù)凍速 率為l5℃/min的凍干大鼠皮和新鮮大鼠皮做藥物滲透性實(shí)驗(yàn)，考察其 組織結(jié)構(gòu)有無(wú)變化。實(shí)驗(yàn)采用裝置為V-lia-chien水平擴(kuò)散池。它是由 兩個(gè)等容積的玻璃半池組成，半池內(nèi)徑為l.35cm，有效擴(kuò)散面積為 1.43cm2，容積為10mL。半池上方開(kāi)口為取樣口，池底有凹陷平 臺(tái)，起到固定攪拌的作用。實(shí)驗(yàn)時(shí)將皮膚固定在擴(kuò)散池的兩個(gè)半池之 間，角質(zhì)層面向供體池。水化1h后，供體池加入10mL尼莫地平的 30%丙二醇水過(guò)飽和溶液，接受池中加入10mL的30%丙二醇水，置 于32℃溫水浴中，磁力攪拌，定時(shí)取樣并更換全部接收介質(zhì)。樣品經(jīng) 徽孔濾膜(0.45nm)過(guò)濾，續(xù)濾液，樣品進(jìn)人高效液相測(cè)定。尼莫地平 外含量測(cè)定采用高效液相色譜法紫外檢測(cè)。色譜條件：色譜柱 Spherisorb46mm×25cm，檢測(cè)波長(zhǎng)237nm，流動(dòng)相是甲醇/水 (64/36)，流速為1.1mL/min，進(jìn)樣量10μL。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5-11所 示。
表5-11正常皮膚和凍干皮膚對(duì)尼莫地平滲透量比較
表5-11中的數(shù)據(jù)表明，在滲透9、10h、12h時(shí)，凍干皮膚與正常皮膚對(duì)藥物尼莫地的滲透量無(wú)顯若性差異。可見(jiàn)，凍干的大鼠皮膚能夠滿足藥理的實(shí)驗(yàn)要求，可用做透皮制的實(shí)驗(yàn)研究，可以長(zhǎng)期貯存?zhèn)溆谩?/span>
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