各種顯微鏡檢術介紹
正立式顯微鏡
一、明視野觀察(Bright field)
明視野鏡檢是大家比較熟悉的一種鏡檢方式,廣泛應用于病理、檢驗,用于觀察被染色的切片,所有顯微鏡均能完成此功能。在此不再贅述。
二、暗視野觀察(Dark field)
暗視野實際是暗場照明發。它的特點和明視野不同,不直接觀察到照明的光線,而觀察到的是被檢物體反射或衍射的光線。因此,視場成為黑暗的背景,而被檢物體則呈現明亮的象。
暗視野的原理是根據光學上的丁道爾現象,微塵在強光直射通過的情況下,人眼不能觀察,這是因為強光繞射造成的。若把光線斜射它,由于光的反射,微粒似乎增大了體積,為人眼可見。
暗視野觀察所需要的特殊附件是暗視野聚光鏡。它的特點是不讓光束由下至上的通過被檢物體,而是將光線改變途徑,使其斜射向被檢物體,使照明光線不直接進入物鏡,利用被檢物體表面反射或衍射光形成的明亮圖象。
暗視野觀察的分辨率遠高于明視野觀察,zui高達0.02-0.004mm..
三、相襯鏡檢法(Phase contrast)
在光學顯微鏡的發展過程中,相襯鏡檢術的發明成功,是近代顯微鏡技術中的重要成就。我們知道,人眼只能區分光波的波長(顏色)和振幅(亮度),對于無色通明的生物標本,當光線通過時,波長和振幅變化不大,在明場觀察時很難觀察到標本.
相襯顯微鏡利用被檢物體的光程之差進行鏡檢,也就是有效地利用光的干涉現象,將人眼不可分辨的相位差變為可分辨的振幅差,即使是無色透明的物質也可成為清晰可見。這大大便利了活體細胞的觀察,因此相襯鏡檢法廣泛應用于倒置顯微鏡。
相襯鏡檢法在裝置上與明場不同,有一些特殊要求:
1.環狀光闌(Ring slit): 裝在聚光鏡的下方,而與聚光鏡組合為一體---相襯聚光鏡。它是由大小不同的環形光闌裝在一圓盤內,外面標有10X、20X、40X、100X等字樣,與相對應倍數的物鏡配合使用。
2.相板(Phase plate): 裝在物鏡的后焦平面處,它分為兩部分,一是通過直射光的部分,為半透明的環狀,叫共軛面;另一是通過衍射光的部分,叫"補償面"。有相板的物鏡稱"相襯物鏡",外殼上常有"Ph"字樣。
相襯鏡檢法是一種比較復雜的鏡檢方法,想要得到好的觀察效果,顯微鏡的調試非常重要。除此之外還應注意以下幾個方面。
1.光源要強,全部開啟孔徑光闌;
2.使用濾色片,使光波近于單色;
四、微分干涉稱鏡檢術(Differential interference contrast DIC)
微分干涉鏡檢術出現于60年代,它不僅能觀察無色透明的物體,而且圖象呈現出浮雕壯的立體感,并具有相襯鏡檢術所不能達到的某些優點,觀察效果更為逼真。
1.原理
微分干涉稱鏡檢術是利用特制的渥拉斯頓棱鏡來分解光束。分裂出來的光束的振動方向相互垂直且強度相等,光束分別在距離很近的兩點上通過被檢物體,在相位上略有差別。由于兩光束的裂距極小,而不出現重影現象,使圖象呈現出立體的三維感覺。
2.微分干涉稱鏡檢術所需的特殊部件:
(1) 起偏鏡
(2) 檢偏鏡
(3) 渥拉斯頓棱鏡2 塊
3.微分干涉稱鏡檢時的注意事項
(1)因微分干涉襯靈敏度高,制片表面不能有污物和灰塵。
(2)具有雙折射性的物質,不能達到微分干涉襯鏡檢鏡檢的效果。
(3)倒置顯微鏡應用微分干涉襯時,不能用塑料培養皿。
五、熒光鏡檢術
熒光鏡檢術是用短波長的光線照射用熒光素染色過的被檢物體,使之受激發后而產生長波長的熒光,然后觀察。熒光鏡檢術廣泛應用于生物,醫學等領域。
1.熒光鏡檢術一般分為透射和落射式兩種類型。
(1)透射式:激發光來自被檢物體的下方,聚光鏡為暗視野聚光鏡,使激發光不進入物鏡,而使熒光進入物鏡。它在低倍情況下明亮,而高倍則暗,在油浸和調中時,較難操作,尤以低倍的照明范圍難于確定,但能得到很暗的視野背景。透射式不使用于非透明的被檢物體。
(2)落射式:透射式目前幾乎被淘汰,新型的熒光顯微鏡多為落射式,光源來自被檢物體的上方,在光路中具有分光鏡,所以對透明和不透明的被檢物體都適用。由于物鏡起了聚光鏡的作用,不僅便于操作,而且從低倍到高倍,可以實現整個視場的均勻照明。
2.熒光鏡檢術的注意事項
(1) 激發光長時間的照射,會發生熒光的衰減和淬滅現象,因此盡可能縮短觀察時間,暫時不觀察時,應用擋板遮蓋激發光。
(2)作油鏡觀察時,應用“無熒光油”。
(3)熒光幾乎都較弱,應在較暗的室內進行。
(4)電源裝穩壓器,否則電壓不穩不僅會降低汞燈的壽命,也會影響鏡檢的效果。
目前許多新興生物研究領域應用到熒光顯微鏡,如基因原位雜交(FISH)等等。
偏光顯微鏡(Polarizing microscope )
一、偏光顯微鏡的特點
偏光顯微鏡是鑒定物質細微結構光學性質的一種顯微鏡。凡具有雙折射的物質,在偏光顯微鏡下就能分辨的清楚,當然這些物質也可用染色發來進行觀察,但有些則不可能,而必須利用偏光顯微鏡。
偏光顯微鏡的特點,就是將普通改變為偏光進行鏡檢的方法,以鑒別某一物質是單折射(各向同行)或雙折射性(各向異性)。
雙折射性是晶體的基本特性。因此,偏光顯微鏡被廣泛地應用在礦物,化學等領域。在生物學和植物學也有應用。
二、偏光顯微鏡的基本原理
偏光顯微鏡的原理比較復雜,在此不作過多介紹,偏光顯微鏡必須具備以下附件(a)起偏鏡 (b)檢偏鏡 (c)無應力物鏡 (d)旋轉載物臺。
三、偏光鏡檢術的方式
(一) 正相鏡檢(Orthscope):又稱無畸變鏡檢,其特點是使用低倍物鏡,不用伯特蘭透鏡(Bertrand Lens),同時為使照明孔徑變小,推開聚光鏡的上透鏡。
正相鏡檢用于檢查物體的雙折射性。
(二) 錐光鏡檢(Conoscope):又稱干涉鏡檢,這種方法用于觀察物體的單軸或雙軸性。
四、 偏光顯微鏡在裝置上的要求
(一) 光源:采用單色光,因為光的速度,折射率,和干涉現象由于波長的不同而有差異。一般鏡檢可使用普通光。
(二) 目鏡:要帶有十字線的目鏡。
(三) 聚光鏡:為了取得平行偏光,應使用能推出上透鏡的搖出式聚光鏡。
(四) 伯特蘭透鏡:這是把物體所有造成的初級相放大為次級相的輔助透鏡。
五、偏光鏡檢術的要求
(一) 載物臺的中心與光軸同軸。
(二) 起偏鏡和檢偏鏡應處于正交位置。
(三) 制片不宜過薄。
倒置顯微鏡(Inverted microscope)
前面講的是正立式顯微鏡的鏡檢方式,主要用于切片的觀察。而倒置顯微鏡是為了適應生物學、醫學等領域中的組織培養、細胞離體培養、浮游生物、環境保護、食品檢驗等顯微觀察。
由于上述樣品特點的限制,被檢物體均放置在培養皿(或培養瓶)中,這樣就要求倒置顯微鏡的物鏡和聚光鏡的工作距離很長,能直接對培養皿中的被檢物體進行顯微觀察和研究。因此,物鏡、聚光鏡和光源的位置都顛倒過來,故稱為“倒置顯微鏡”。
由于工作距離的限制,倒置顯微鏡物鏡的zui大放大率為60X。一般研究用倒置顯微鏡都配置有4X、10X、20X、及40X 相差物鏡,因為倒置顯微鏡多用于無色透明的活體觀察。如果用戶有特殊需要,也可以選配其它附件,用來完成微分干涉、熒光及簡易偏光等觀察。
目前倒置顯微鏡廣泛應用于patch-clamp ,transgene ICSI 等領域。
體視顯微鏡(Stereo microscope)
體視顯微鏡又稱“實體顯微鏡”或“解剖鏡”,是一種具有正象立體感地目視儀器,被廣泛地應用于生物學、醫學、農林、工業及海洋生物各部門。它具有如下地特點:
1. 雙目鏡筒中的左右兩光束不是平行,而是具有一定的夾角---體視角(一般為12度---15度),因此成象具有三維立體感;
2. 象是直立的,便于操作和解剖,這是由于在目鏡下方的棱鏡把象倒轉過來的緣故;
3. 雖然放大率不如常規顯微鏡,但其工作距離很長
4. 焦深大,便于觀察被檢物體的全層。
5. 視場直徑大。
目前體視鏡的光學結構是:由一個共用的初級物鏡,對物體成象后的兩光束被兩組中間物鏡----變焦鏡分開,并成一體視角再經各自的目鏡成象,它的倍率變化是由改變中間鏡組之間的距離而獲得的,因此又稱為“連續變倍體視顯微鏡”(Zoom—stereo microscope)。
隨著應用的要求,目前體視鏡可選配豐富的選購附件,如熒光,照相,攝象,冷光源等等。