ELISA法檢測干擾素

干擾素（IFN）是一類具有廣譜抗病毒活性的蛋白質(zhì)，僅在同種細(xì)胞上發(fā)揮作用。根據(jù)其來源、理化及生物學(xué)性質(zhì)的不同，可分為IFN-α、IFN-β、IFN-γ3種干擾素。其中，IFN-α主要由白細(xì)胞產(chǎn)生，IFN-β由成纖維細(xì)胞產(chǎn)生，IFN-γ主要由T細(xì)胞在免疫應(yīng)答中受到抗原或絲裂原活化后分泌產(chǎn)生。3種干擾素中，IFN-α、IFN-β抗病毒作用較強(qiáng)，IFN-丁免疫調(diào)節(jié)作用較強(qiáng)。目前已可用基因重組技術(shù)制備干擾素投入臨床使用。干擾素不能直接滅活病毒，其抗病毒作用是由于它能激活細(xì)胞內(nèi)抗病毒蛋白基因，制造抗病毒蛋白，抑制病毒在體內(nèi)復(fù)制。干擾素不僅可抑制已感染細(xì)胞內(nèi)病毒的復(fù)制，而且還可使未感染細(xì)胞處于抗病毒狀態(tài)，對中斷病毒的細(xì)胞間傳播有一定作用；但對病毒整合基因可能僅有暫時(shí)抑制其mRNA的轉(zhuǎn)錄作用，不能清除病毒基因。干擾素的免疫調(diào)節(jié)作用表現(xiàn)為它是重要的巨噬細(xì)胞活化因子（macro-phageactivating factor，MAF），活化的巨噬細(xì)胞能殺死病原微生物或殺傷腫瘤細(xì)胞。干擾素能增強(qiáng)各種細(xì)胞表達(dá)MAF分子從而有利于遞呈抗原或利于T細(xì)胞對靶細(xì)胞的識(shí)別和殺傷；還能促進(jìn)T、B細(xì)胞的分化，活化NK細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，從而有助于加強(qiáng)免疫應(yīng)答。由于干擾素不是一種淋巴細(xì)胞的生長因子，故常抑制淋巴細(xì)胞（特別是B細(xì)胞）的增殖。
IFN抗病毒活性的特點(diǎn)如下：①僅僅是抑制作用，IFN消失后病毒將重新復(fù)制，因此必須足量反復(fù)應(yīng)用；②有相對的種屬特異性，IFN-γ較IFN-α、IFN-β嚴(yán)格；③IFN不直接滅活病毒，而是通過細(xì)胞基因組產(chǎn)生另一些蛋白因子來發(fā)揮效能，因此不同細(xì)胞對IFN的敏感性不同；④不同感染狀態(tài)的病毒-細(xì)胞系統(tǒng)對IFN的敏感性不同，病毒大量復(fù)制、引起細(xì)胞炎癥應(yīng)答時(shí)，IFN易產(chǎn)生效應(yīng)；對完整細(xì)胞中的整合型病毒無作用。
[檢測方法] ELISA法
[方法學(xué)原理] 抗人IFN抗體包被在微孔反應(yīng)板上，待測標(biāo)本和標(biāo)準(zhǔn)品中的IFN會(huì)與抗人IFN抗體結(jié)合，游離的成分被洗去，同時(shí)加入生物素化的抗人IFN抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素。生物素與親和素特異結(jié)合，抗人IFN抗體與結(jié)合在單克隆抗體上的人IFN結(jié)合而形成免疫復(fù)合物，游離的成分被洗去。加入顯色劑，若反應(yīng)孔中有IFN，HRP會(huì)使五色的顯色劑呈現(xiàn)藍(lán)色，加終止液變。在波長450nm處測吸光度，IFN濃度與吸光度成正比，可通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中的IFN濃度。
[標(biāo)本準(zhǔn)備] 靜脈血2ml，不抗凝。
[試劑）
1．預(yù)包被微孔反應(yīng)板
2．濃縮酶結(jié)合物
3．酶結(jié)合物稀釋液
4．標(biāo)準(zhǔn)晶和標(biāo)本稀釋液
5．濃縮生物素化抗體
6．TFN標(biāo)準(zhǔn)品
7．濃縮洗滌液
8.顯色劑A、B
9．終止液
[儀器] 酶標(biāo)儀或全自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測儀。
[檢測步驟]
1．在微孔反應(yīng)板相應(yīng)孔中分別加入待測樣本、不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品100ul，再加生物素化抗體工作液50ul。
2．振蕩混勻，置20～25℃環(huán)境中溫育120min。
3．將孔內(nèi)液體吸干，用洗滌液充分洗滌5次，干燥。
4．除空白孔外，加入酶結(jié)合物工作液100u1。
5．振蕩混勻，置20～25℃環(huán)境中溫育30min。
6．將孔內(nèi)液體吸干，用洗滌液充分洗滌5次，干燥。
7．每孔加入顯色劑A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃環(huán)境中避光顯色10min。
8．加入終止液50gl后，輕輕振蕩混勻。用酶標(biāo)儀（450nm波長）測定各孔吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對照，求出IFN值。
[正常參考值] 各實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)檢測方法的不同確立正常參考值。
[注意事項(xiàng)]
1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出時(shí)應(yīng)在室溫環(huán)境中平衡30min后方可使用，來用完的微孔條用自封袋密封保存。
2．酶標(biāo)板洗滌時(shí)各孔均需加滿洗滌液，防止孔內(nèi)有游離酶不能洗凈。應(yīng)設(shè)定30-60s的洗滌浸泡時(shí)間。
3。滴加試劑前應(yīng)將滴瓶翻轉(zhuǎn)數(shù)次，使液體混勻。滴加時(shí)瓶身應(yīng)保持垂直，以使滴量準(zhǔn)確。
4.所有樣品和廢棄物都應(yīng)按傳染源處理。終止液為2mol／L硫酸，使用時(shí)應(yīng)注意安全
5.每批樣本應(yīng)同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
6.檢測劑工作液按說明書臨用前配置。
7.若標(biāo)本OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線測定范圍以外，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測。
[臨床意義] IFN水平的改變主要見于自身免疫性疾病；在感染性疾病中，升高見于急性病毒感染，降低見于乙型肝炎病毒攜帶者、其他慢性病毒性肝炎及AIDS患者。