特殊細胞系培養基

時間：2011-4-12閱讀：1538

培養某一類型細胞沒有固定的培養條件。在MEM中培養的細胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長。總之，MEM做粘附細胞培養、RPMI-1640做懸浮細胞培養是一個好的開始，各種目的無血清培養AIM V（12005）培養基（SFM）。

L-谷氨酰胺在細胞培養中重要嗎？它在溶液中不穩定嗎？
L-谷氨酰胺在細胞培養時是重要的。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養細胞的能量來源、參與蛋白質的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經過一段時間后會降解，但是確切的降解率一直沒有zui終定論。L-谷氨酰胺的降解導致氨的形成，而氨對于一些細胞具有毒性。

GlutaMAX-I是什么？培養細胞如何利用GlutaMAX-I？這個二肽有多穩定？
GlutaMAX-I 二肽是一個L-谷氨酰胺的衍生物，其不穩定的alpha-氨基用L-丙氨酸來保護。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L-谷氨酰胺供利用。

GlutaMAX-I二肽非常穩定，即使在121磅滅菌20分鐘，GlutaMAX-I 二肽溶液有zui小的降解，如果在相同條件下，L-谷氨酰胺幾乎*降解。

什么培養基中可以省去加酚紅？
酚紅在培養基中被用來作為PH值的指示劑：中性時為紅色，酸性時為，堿性時為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用，（特別是雌激素）。為避免固醇類反應，培養細胞，尤其是哺乳類細胞時，用不加酚紅的培養基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細胞檢測時，不使用加有酚紅的培養基。

酚紅在培養基中被用來作為PH值的指示劑：中性時為紅色，酸性時為，堿性時為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用，（特別是雌激素）。為避免固醇類反應，培養細胞，尤其是哺乳類細胞時，用不加酚紅的培養基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細胞檢測時，不使用加有酚紅的培養基。

如何用臺盼蘭計數活細胞？
用無血清培養基把細胞懸液稀釋到200～2000個/毫升，在0.1毫升的細胞懸液中加入0.1毫升的0.4％的臺盼蘭溶液。輕輕混勻，數分鐘后，用血球計數板計數細胞。活細胞排斥臺盼蘭，因而染成藍色的細胞是死細胞。

如何消除組織培養的污染？
當重要的培養污染時，研究者可能試圖消除或控制污染。首先，確定污染物是細菌、真菌、支原體或酵母，把污染細胞與其它細胞系隔離開，用實驗室消毒劑消毒培養器皿和超凈臺，檢查HEPA過濾器。

高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細胞系有毒性，因而，做劑量反應實驗確定抗生素和抗霉菌素產生毒性的劑量水平。這點在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養污染的實驗步驟。

1.	在無抗生素的培養基中消化、計數和稀釋細胞，稀釋到常規細胞傳代的濃度。
2.	分散細胞懸液到多孔培養板中，或幾個小培養瓶中。在一個濃度梯度范圍內，把選擇抗生素加入到每一個孔中。例如，兩性霉素B推薦下列濃度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。
3.	每天觀測細胞毒性指標，如脫落，出現空泡，匯合度下降和變圓。
4.	確定抗生素毒性水平后，使用低于毒性濃度2～3倍濃度的抗生素的培養液培養細胞2～3代。
5.	在無抗生素的培養基中培養細胞一代。
6.	重復步驟4。
7.	在無抗生素的培養基中培養4～6代，確定污染是否以已被消除。

培養基中丙酮酸鈉的作用是什么？
丙酮酸鈉可以作為細胞培養中的替代碳源，盡管細胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒有葡萄糖的話，細胞也可以代謝丙酮酸鈉。

Hank's 平衡鹽溶液（HBS）要在空氣中使用，不需要CO2培養箱。原因是什么？Hank's 平衡鹽溶液（HBS）和Earle's平衡鹽溶液（EBS）有什么本質的功能差別？
HBS和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平,在Eagles （2.2g/L）中比在Hanks （0.35g/L）中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡，以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中，溶液會變堿，Hanks液在CO2培養箱中會變酸。如果希望在CO2培養箱中保存組織，需要用Eagles液，。如果僅僅是清洗將要在細胞培養基中儲存的組織，用Hanks液就可以了。

二價離子抑制胰蛋白酶活性嗎？使用胰蛋白酶時加入EDTA的目的是什么？
二價離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細胞前，用EDTA清洗細胞，以消除來自培養基中所有的二價離子。

我試用SF900 II時，細胞生長良好，但是我的蛋白產物不如使用Graces 液和10%胎牛血清時效果好。
如果目的蛋白是一個后期蛋白，它將與蛋白酶一起表達，這些蛋白酶將會作用于目的蛋白。在加有血清的培養基中，這些蛋白酶將作用到血清中的蛋白，從而使目的蛋白產品保持完好。在無血清配方中，蛋白酶作用的*底物是你的目的蛋白。為了避免這一問題，加入一些蛋白酶抑制劑或加入少量的血清（少于1％），讓血清給蛋白酶提供作用底物。

20°C下配制的緩沖液，在較高或較低的溫度下PH值會改變嗎？
對于普通使用的緩沖液，PH值隨溫度變化而變化。

下表列出溫度改變10℃時，PH值的變化情況：

例如 20℃下配制PH7.4 Tris緩沖液,40℃時PH值為 7.4-（2x0.310）＝6.78

緩沖系統 pKa/20℃ [ Delta]pKa/10℃

Mes 6.15 -0.110
Ada 6.60 -0.110
Pipes 6.80 -0.085
Aces 6.90 -0.200
Bes 7.15 -0.160
Mops 7.20 -0.013
Tes 7.50 -0.200
Hepes 7.55 -0.140
Tricine 8.15 -0.210
Tris 8.30 -0.310
Bicine 8.35 -0.180
Glycylglycine 8.40 -0.280

室溫下（25?）配制的Tris-HCl溶液，在37℃使用時PH值是多少？

緩沖液的PH值隨溫度變化而變化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃，25℃，37℃時，不同的PH值。

4°C	25°C	37°C
8.1	7.5	7.2
8.2	7.6	7.3
8.3	7.7	7.4
8.4	7.8	7.5
8.5	7.9	7.6
8.6	8.0	7.7
8.7	8.1	7.8
8.8	8.2	7.9
8.9	8.3	8.0
9.0	8.4	8.1
9.1	8.5	8.2
9.2	8.6	8.3
9.3	8.7	8.4
9.4	8.8	8.5

室溫下（25?）配制的Tris-HCl溶液，在37℃使用時PH值是多少？

緩沖液的PH值隨溫度變化而變化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃，25℃，37℃時，不同的PH值。

昆蟲細胞培養的zui適PH值和滲透壓是多少？
生長培養基的PH值對細胞的增殖和病毒或重組蛋白的生產均會產生影響。對于大部分鱗翅類昆蟲細胞系，在PH值 6.0～6.4范圍的大部分應用效果良好。培養鱗翅類昆蟲細胞系時，培養基的zui適滲透壓是345-380mOsm/kg.。為保證可靠和持久的細胞培養方式，減少技術問題，保持PH值和滲透壓在以上所列的范圍之內。

胰酶消化一個T25瓶的sf9細胞：

1.	去除培養基。
2.	用2ml 1xPBS（足以覆蓋細胞表面）洗滌細胞，去除PBS。
3.	加入2ml 1x胰酶EDTA（恰好覆蓋細胞表面）。
4.	37 ℃孵育5到10分鐘。在儀器下檢測看到5分鐘后它們正在向上移動。
5.	向細胞中加入2ml 細胞培養液，移入錐形管，用2ml培養液洗瓶壁，移入同一錐形管中。（培養基中的FBS終止了胰酶的活性。）
6.	離心（1100rpm）沉淀細胞。去除培養基。

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