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Ramina 應用實例｜實時監測細胞培養性能測試
前言
拉曼光譜在復雜水體系中反映組分微小變化的能力深化了該技術在生物制藥過程分析（如生物反應器中的細胞生長）方面的應用。拉曼光譜儀技術可以實時、原位和無損地監測生物制藥生產過程，可用于復雜化學體系的連續過程監測。拉曼光譜技術在生物反應過程中可檢測大量代謝物變化的能力已將該技術提升為強大的過程分析工具。
實驗概述
拉曼光譜分析光學探頭具有可重復使用的特點，通過減少運行間的可變性來提高過程監測的可重復性和可靠性。Thermo Scientific™ Ramina™ 過程分析儀可匹配多個光纖探頭。MarqMetrix 生物反應器球形探頭是專為滿足生物工藝工業的要求而設計的，可以搭載到 Ramina 過程分析儀上使用。這些探頭具有快速、易于更換和連接以及耐用等特點，可以進行無菌處理，比如離線的高壓滅菌。
DynaDrive 一次性生物反應器(S.U.B.)是 S.U.B. 技術的最新產品，為大規模生物生產提供了更好的性能，并具備可擴展性。與傳統的 S.U.B. 設計相比，長方體的罐體具有幾個關鍵優勢，包括*的混合和傳質能力以及更好的可擴展性。
本應用介紹了Ramina過程分析儀系統與 500L HyPerforma DynaDrive 生物反應器的集成，并實現關鍵過程參數(CPPs)的在線測量，通過采集整個細胞生長培養過程中連續生成的光譜數據建立起若干參數和代謝物的精確預測模型。
材料與方法
細胞培養和喂養策略
細胞培養在500L HyPerforma DynaDrive S.U.B 中進行（見下圖1），其中包含體積約為320L細胞培養基，在36.5℃，pH=6.9+/-0.3, DO=50%的條件下接種0.5x106個細胞/mL。體系的 pH 值通過添加二氧化碳氣體和碳酸鈉來控制。
細胞在化學定義的培養基中生長，從第3天開始每天進行兩步喂養過程。第一種喂養介質以起始體積的重量為4%添加，第二種喂養介質以0.4%添加。第6天體系溫度轉為33°C。試驗在14天后終止。生物反應器避光處理以防止雜散光干擾。在高壓滅菌后，將 Ramina 過程分析儀生物反應器球形探頭插入HyPerforma DynaDrive S.U.B. 中，進行在線實時拉曼光譜數據采集。
圖1.500L Thermo Scientific HyPerforma
DynaDrive S.U.B. 細胞培養罐
Ramina 過程分析儀測試
使用 Ramina 過程分析儀進行數據采集（見下圖2）， Ramina 過程分析儀的生物反應器球形探頭直接浸入在生物反應器(500L) 中，每平均20次測量獲取一張拉曼光譜數據，積分/曝光時間為3秒，激光功率設置為450mW。每個數據光譜的總采集時間為2分鐘，在 Ramina 過程分析儀用以建立模型數據與離線儀器分析通過匹配時間戳以確認。
圖2.Thermo Scientific™ Ramina™
在線拉曼分析儀
化學計量學模型建立
來自多臺 Ramina 過程分析儀、探頭和生物反應器的數據被用于創建模型。訓練數據集從每個生物反應器的45個樣本中收集，以創建每個化學計量學模型。對光譜數據進行了檢查，剔除了由宇宙射線引起的異常譜峰。選擇感興趣的光譜區域，并對光譜進行預處理，以去除基線干擾并優化信噪比。
建模過程中測試了許多預處理技術，包括Savitzky Golay濾波、自動Whitaker平滑、多元散射校正、SNV和均值中心化。根據建模的關注點選擇優化不同的預處理技術。為每個感興趣的組分創立偏最小二乘(PLS)模型并進行交叉驗證以測試每個模型的優化的效果。這些組分包括葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺、谷氨酸、TCD、VCD和其他在生物反應器培養過程中產生的常見代謝物。
結果
在這項工作中，在線拉曼光譜儀應用于連續分批補料 CHO 細胞培養過程。使用拉曼光譜監測工藝參數首先需要使用外部校準數據集（獨立離線數據）建立化學計量學模型，通過對感興趣的參數的離線分析數據和對應的在線拉曼光譜數據的關聯關系建立模型。
為了評估 Ramina 過程分析儀預測值的準確性，每天收集生物反應器數據并進行分析比較。計算每個參數(RMSEP)的校準均方根誤差(RMSEC)、交叉驗證均方根誤差 (RMSECV)和預測均方根誤差。根據模型的預測計算平均誤差，得到用于構建模型的 RMSECV。用模型未見過的“新"數據來測試模型，依據參數RMSEP判斷。為每個 PLS 模型記錄變異系數 R2。該值用于確定模型預測變量（X 變量）可以解釋的 Y 變量的變化量。
值得一提的是，結合使用來自同一 CHO 培養過程的生物反應器運行的幾個大型獨立數據集，可以產生更準確和穩健的預測化學計量學模型。在這項研究中，來自之前生物反應器運行的五個獨立數據集被組合起來訓練一個大型化學計量學模型。然后將校準模型應用于此次 Hyperforma DynaDrive S.U. B 生物反應器的預測。數據表明該模型能夠準確預測這個新數據集，并且模型預測與離線收集的眾多代謝物的數據測量高度相關，如下表1所示。
表1.模型預測值與離線數據的相關性
下圖為賽默飛Hyperforma DynaDrive S.U.B.化學計量學模型預測——各重要參數的拉曼預測模型和離線數據對比。
結論
可重復使用MarqMetrix生物反應器BallProbe 探頭具有TouchRaman浸沒技術，連接Ramina過程分析儀，可對500L HyPerforma DynaDrive S.U.B.中的關鍵過程參數葡萄糖、谷氨酰胺和乳酸以及總細胞密度和活細胞密度進行準確的在線實時預測。相關性分析顯示模型預測數據與離線分析數據之間具有良好的一致性，表明模型能穩健地應用于上表1中所示參數的預測。