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01
大腸菌群定義和衛生學意義
大腸菌群定義：
在一定培養條件下能發酵乳糖、產酸產氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽孢桿菌。大腸菌群不是細菌學上分類命名，它不代表某一種或某一屬的細菌，而是一組與糞便污染有關的細菌。這群細菌包括：埃希氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、產氣克雷伯氏菌屬、腸桿菌屬（又叫產氣桿菌屬，包括陰溝腸桿菌和產氣腸桿菌）和等。
衛生學意義：
大腸菌群作為糞便污染的指標菌評價樣品中是否受到糞便的污染。表示了對人體健康是否具有潛在的危險性。直接反映了樣品受糞便污染的程度。
02
GB4789.3-2016 大腸菌群MPN法
1
什么是MPN法?
MPN法是統計學和微生物學結合的一種定量檢測法。待測樣品經系列稀釋并培養后，根據其未生長的zui低稀釋度與生長的最高稀釋度，應用統計學概率論推算出待測樣品中大腸菌群的最大可能數。
MPN值并不能表示實際菌落數，實際菌落數有可能落在置信區間內的任何一點，MPN值是落在這個置信區間內概率最大的一點。
靈敏度較高，適用于污染菌落較少的樣品。
2
大腸菌群MPN計數的檢驗操作
操 作 注 意 事 項
1
建議用磷酸鹽緩沖液作為稀釋液，因為磷酸鹽緩沖液能更好地糾正食品樣品中pH變化，對細菌具有保護作用。
2
初發酵接種量超過1mL，則用雙料LST肉湯。
3
培養基檢查。加入樣品前應觀察導管內是否有氣泡，若有，應適當傾斜試管，讓氣體排出。
4
結果觀察。某些食品樣品可能會堵塞小導管底部，影響導管內氣泡的觀察，可將試管微微傾斜，用手指輕彈管壁，觀察是否有一串小氣泡沿管壁升起，若有，則判定產氣。
3
培養基原理解析
月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯(LST)：
? 月桂基硫酸鹽能抑制革蘭氏陽性菌生長，胰蛋白胨提供碳源和氮源滿足細菌生長的需求；氯化鈉可維持均衡的滲透壓；乳糖是大腸菌群可發酵的糖類；磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀是緩沖劑。
? 36±1℃培養24h后若已產氣，則可停止培養。如果沒有觀察到有產氣的現象，則繼續培養至48±2h。
? 如接種量超過1mL，則用雙料LST肉湯。
煌綠乳糖膽鹽肉湯(BGLB)：
? 膽鹽與煌綠均能抑制革蘭氏陽性菌生長。
? 培養基配方當中含有膽鹽，大腸菌群發酵乳糖所產的酸會與膽鹽發生反應，形成膽酸沉淀。培養基可由原來的綠色變為黃色。
4
大腸菌群最大可能數(MPN)報告
確證的大腸菌群BGLB陽性管數，檢索MPN表，報告每1g(mL)樣品中大腸菌群的MPN值
當實驗結果在MPN表中無法查找到MPN值時，如：陽性管數為122，123，232，233等時，建議增加稀釋度(可做4~5個稀釋度)，使樣品最高稀釋度能達到陰性終點(如果污染程度不能判定，則多加一稀釋度)，然后再遵循相關的規則進行查找，最終確定MPN值。
表B.1
大腸菌群最可能數(MPN)檢索表
03
GB4789.3-2016大腸菌群計數平板法
1
大腸菌群平板計數法流程圖
操 作 注 意 事 項
1
平板法相對MPN法來說，結果更加直觀精確。長成的一個單菌落也可能來自樣品中的2~3或更多個細胞。因此平板菌落計數的結果往往偏低。適用于污染較為嚴重的樣品。
2
從一個樣品取樣到傾注瓊脂平板，應在15分鐘內完成。
3
檢驗所用物品應無菌，無抑菌殘留物。
4
BGLB確證試驗需從VRBA平板上挑起至少10個典型和可疑菌落進行，如平板上菌落數少于10個，則挑取全部典型和可疑菌落進行確證。
2
培養基原理解析
結晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)：
? 配方中膽鹽和結晶紫抑制革蘭氏陽性菌，中性紅作為指示劑，在酸性條件下為紫紅色。
? 大腸菌群分解乳糖所產的酸與膽鹽結合，可形成粉紅色菌落菌落周圍有膽酸鹽沉淀環。
? 該培養基無需高溫高壓滅菌，現配現用。
3
計數典型和可疑菌落數
大腸菌群定義：
選取菌落數在15CFU~150 CFU之間的平板，分別計數平板上出現的典型和可疑大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環，菌落直徑為0.5mm或更大。
證實試驗：
從各樣品中接種同一樣品濃度的VRBA平板上共挑取10個不同類型的典型和可疑菌落，分別移種于BGLB肉湯管內，36℃±1℃培養24h~48h，觀察產氣情況。凡BGLB肉湯管產氣，即可報告為大腸菌群陽性。
4
大腸菌群平板計數的報告
經最后證實為大腸菌群陽性的試管比例乘以計數的平板菌落數，再乘以稀釋倍數，即為每g(mL)樣品中大腸菌群數。例：10-4樣品稀釋液1mL，在VRBA平板上有100個典型和可疑菌落，挑取其中10個接種BGLB肉湯管，證實有6個陽性管，則該樣品的大腸菌群數為：
100×6/10×104/g(mL)=6.0×105CFU/g(mL)。
若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無菌落生長，則以小于1乘以zui低稀釋倍數計算。
04
質量控制
實驗室過程中，每批樣品稀釋液都要做空白對照。
為了控制環境污染，每次檢驗過程中，于檢驗臺上打開兩塊計數瓊脂平板，并在檢驗環境中暴露不少于15分鐘，將此平板與本批次樣品同時進行培養，以掌握檢驗過程中是否存在來自檢驗環境的污染。
定期使用大腸埃希氏菌ATCC25922或相應定量活菌參考品，在P2實驗室或陽性對照實驗室內，用適當的食品樣品進行陽性實驗驗證，并進行記錄，次驗證實驗至少每2個月進行1次。
05
大腸菌群測試片法
1
原理
大腸菌群檢測片由輕便防水紙質材料做支撐，其上覆蓋干燥培養基層(營養物質、凝固劑、選擇抑制劑、顯色劑)和透明隔水膜組成，經輻照滅菌。可用于食品、飲料等的大腸菌群計數。含有四氮唑指示劑菌落為紅色，發酵乳糖產酸和產氣。
2
培養基原理解析
菌落計數特別方便(容易判讀)，紅色菌落，易于食品顆粒分開，無菌落重疊現象；
菌落分布特別均勻；
避免了培養基對細菌熱損傷有關；
菌落蔓延或半透明菌膜現象很少發生；
經濟環保無粉塵，體積小，重量輕，易儲運；
保質期長干制無水培養基，性質穩定，保質期更長。
3
使用說明
06
所需培養基試劑和質控菌株
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