大鼠神經絲蛋白(NF)免疫組化試劑盒
該試劑盒以HRP標記的鏈霉親和素復合物(HRP Streptavidin Conjugate,HRP-SA)為基礎,可用于檢測細胞、組織內的特異性神經絲蛋白(NF)抗原。該試劑盒具有靈敏度高、特異性強、定性定位準確、背景清晰。在所用的神經絲蛋白(NF)一抗與相應靶抗原結合后,用生物化二抗與一抗特異性結合,后加入HRP-SA,形成抗原—特異一抗—生物素化二抗—HRP-SA復合物,顯微鏡下觀察成像。
試劑盒所含試劑:
試劑A 通透液:0.1% Triton-X 100 10 mL(選用)
試劑B 封閉緩沖液(封閉用) 20 mL
試劑C (*分裝)已稀釋的即用型神經絲蛋白(NF)一抗(2.5ml)
試劑D (*分裝)生物素化羊抗兔IgG 1支
(濃度1.5 mg/mL,稀釋比為1:300~1:500)50 μL+抗體稀釋液20ml
試劑E HRP-SA復合物1支(濃度1 μM,稀釋比1:50~1:200)100 μL
試劑F DAB顯色液 5ml
用戶自備試劑:
1. 10mM TBS(pH7.2~7.4)
三羥基氨基甲完烷1.21g
氯化鈉7.6g
加蒸餾水800mL,濃鹽酸調pH值至7.2~7.4,后定容至1000mL
TBS-T:TBS+Tween 20(0.05%體積比)
2.抗原修復液(依檢測抗原不同而選擇不同的修復液)
10mM pH6.0 檸檬酸緩沖液
檸檬酸0.38g
檸檬酸三鈉2.45g
加蒸餾水900mL,濃鹽酸調pH值至6.0,后定容至1000mL
或:0.5M EDTA修復液(pH8.0)
EDTA·2H2O 186.1g
檸檬酸三鈉2.45g
加蒸餾水700mL,用10mM NaOH調pH值至8.0,后定容至1000Ml
3. 緩沖甘油封固劑10 mL
4. Tween 20 5 mL
石蠟包埋組織切片免疫染色
實驗步驟(建議方案):
石蠟包埋組織切片3~4μm 厚度
1.烤片: 將待做切片置于切片架上,于60℃恒溫烤箱中至少烤1 hr;
2.脫蠟: 切片放入盛有二甲本苯的容器中脫蠟3次(即二甲本苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ),每次10 min;
3.水化: 切片經下行酒精水化,無水乙醇5min,95%乙醇2次(每次2min),85%乙醇2 min;75%乙醇2min,自來水沖洗,ddH2O洗2×2min;
4.抗原修復: 根據抗體說明書推薦方法進行抗原修復,常采用高壓、微波(溫度達到98~100℃)或酶消化修復法,室溫自然冷卻,自來水沖洗,ddH2O洗2×2min,TBS洗滌(2×2min)(具體修復方法見附1)* 注:有些抗原勿需修復,直接進入第5步封閉。
5.封閉: 滴加試劑B,37℃濕盒孵育30 min;
6.加一抗:滴加用試劑C(即用型一抗),37℃濕盒孵育2 hr 或4℃過夜;
7.洗滌: TBS-T洗滌(3×5 min);
8.封閉: 滴加試劑B,37℃濕盒孵育10 min;
9.加二抗: 滴加用抗體稀釋液稀釋的生物素化二抗(試劑D),37℃濕盒中孵育30 min;
10.洗滌: TBS-T洗滌(3×5 min);
11.封閉: 滴加試劑Tween 20,37℃濕盒孵育封閉20 min;
12.加HRP-SA: 滴加用抗體稀釋液稀釋的試劑E(1:50~200,終濃度5~20 nM),37℃濕盒中孵育30 min;
13.洗滌: TBS-T洗滌(3×5 min),TBS洗滌(2×5 min);
14.顯色:應用DAB溶液(試劑F)顯色;
15.復染:自來水充分沖洗,復染,脫水,透明;
16.封片: 待組織標本干后,用試劑緩沖甘油封固劑封片;
17.觀察成像: 顯微鏡下觀察成像。
注意事項:
1. 修復后緩沖液須自然冷卻,自來水沖洗后方能把切片取出,驟冷有可能導致結晶或抗原封閉。
2. 緩沖液的量必須保證所有切片都能浸泡到,用過的檸檬酸緩沖液不能反復使用。
3. 若試劑為微量濃縮液,用前應低速離心,將內蓋和管壁附著的溶液離到底部。
4. 封片前一定要換用TBS充分洗滌,以便洗去組織上殘留的Tween 20,否則會影響結果觀察。
5. 如須復染細胞核,則在封片前復染或直接采用含有染核試劑的封片劑進行封片。
附1:
抗原修復方法
常用抗原修復液:檸檬酸緩沖液(0.01M pH6.0)、EDTA抗原修復液(pH8.0或9.0)等等。
一、酶消化修復法
切片脫蠟水化處理,TBS沖洗,在組織上滴加胃蛋白酶或胰蛋白酶,37℃孵育20~30min后TBS沖洗即可。
二、微波抗原修復法
微波盒中加入抗原修復液微波加熱至沸騰,將脫蠟水化后的切片置于耐高溫塑料切片架上,放入已沸騰的緩沖液中,中檔或高檔繼續微波10~15min,取出微波盒冷卻至室溫后,自來水沖洗,取出切片。因不同微波爐微波處理時間存在差異,須自行調整。
三、直接高壓抗原修復法
取修復液于不銹鋼高壓鍋中加熱至沸騰,將組織切片置于耐高溫切片架上,修復液沸騰后放入切片架,蓋上鍋蓋,待噴氣后計時1.5~2.5min即可脫離熱源,自然冷卻至室溫后自來水沖洗,取出切片。此方法適用于較難檢測或核抗原的修復。
四、隔水式高壓抗原修復法
不銹鋼高壓鍋中加自來水加熱至沸騰,微波盒中加入修復液于微波爐中加熱至沸騰,將切片放入微波盒中,再將微波盒放入高壓鍋中蓋上鍋蓋,待噴氣后計時4~8 min即可關閉熱源,自然冷卻至室溫后自來水沖洗,取出切片。此方法適用于較難檢測或核抗原的修復。