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輔酶ⅡNADP（H）含量試劑盒

產(chǎn)品簡介 ：
    NADP + 和 NADPH 含量測定可以計算 NADP（NADPH + NADP + )含量和 NADPH/NADP + 比值，其變化與磷酸戊糖途徑和生物合成以及抗氧化反應(yīng)密切相關(guān)。 NADPH/NADP + 比值不僅是細(xì)胞氧化還原態(tài)的主要標(biāo)志之一，而且在 PPP 途徑、生物合成和抗氧化代謝中具有重要調(diào)控作用。
    分別用酸性和堿性提取液提取樣品中 NADP + 和 NADPH。NADPH 通過 PMS 的遞氫作用，使氧化型噻唑藍(lán)（MTT）還原為甲瓚，570nm 下檢測吸光值，從而測定 NADPH 含量。利用 6-磷酸葡萄糖脫氫酶還原NADP + 為 NADPH，從而檢測 NADP + 含量。

試驗中所需的儀器和試劑：
   可見分光光度計或酶標(biāo)儀、臺式離心機、可調(diào)式移液器、1 mL 玻璃比色皿或酶標(biāo)板、研缽、冰和蒸餾水。

產(chǎn)品內(nèi)容 ：

酸性提取液：50mL×1 瓶，4℃保存；
堿性提取液：50mL×1 瓶，4℃保存；
試劑一：基質(zhì)緩沖液 15 mL×1 瓶，4℃保存；
試劑二：粉劑×1 支，-20 ℃保存，用時加入 4mL 雙蒸水，混勻；
試劑三：粉劑×1 支，-20℃保存，用時加入 4mL 雙蒸水，混勻；
試劑四：粉劑×1 支，4 ℃保存，用時加入 4mL 雙蒸水，混勻；
試劑五：液體 1.8mL×1 支，4 ℃保存；
試劑六：液體 30mL×1 瓶，4 ℃保存；
試劑七：液體 50mL×1 瓶，4 ℃保存。

操作步驟 ：
一 、NADP  和 和 NADPH  的提取 ：
1、血清（漿）中 NADP 和 NADPH 的提取：
    取 0.1mL 血清（漿），加入 0.9mL 酸性提取液，煮沸 5min；冰浴中冷卻后，10000g 4℃離心 10min；

    取上清液另一新的離心管中，加入等體積的堿性提取液使之中和；10000g 4℃離心 10min，取上清液冰上保存供測定 NADP + 含量。
    取 0.1mL 血清（漿），加入 0.9mL 堿性提取液，煮沸 5min,冰浴中冷卻后，10000g 4℃離心 10min，取上清液另一新的離心管中，加入等體積的酸性提取液使之中和，10000g 4℃離心 10min，取上清液冰上保存供測定 NADPH 含量。
2、組織中 NADP 和 NADPH 的提取：
    稱取約 0.1g 組織， 加入 0.9mL 酸性提取液， 冰浴研磨， 煮沸 5min， 冰浴中冷卻后， 10000g 4℃離心 10min，取上清液另一新的離心管中，加入等體積的堿性提取液使之中和，10000g 4℃離心 10min，取上清液冰上保存供測定 NADP + 含量。
    稱取約 0.1g 組織， 加入 0.9mL 堿性提取液， 冰浴研磨， 煮沸 5min， 冰浴中冷卻后， 10000g 4℃離心 10min，取上清液另一新的離心管中，加入等體積的酸性提取液使之中和，10000g 4℃離心 10min，取上清液冰上保存供測定 NADPH 含量。
3、細(xì)胞或細(xì)菌中 NADP 和 NADPH 的提取：
    先收集 400-500 萬細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，棄上清，加入 0.9mL 酸性提取液，超聲波破碎 1min（強度20％，超聲 2s，停 1s），煮沸 5min，冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min，取上清液另一新的離心管中，加入等體積的堿性提取液使之中和，10000g 4 ℃離心 10min，取上清液冰上保存供測定 NADP + 含量。
    先收集 400-500 萬細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，棄上清，加入 0.9mL 堿性提取液，超聲波破碎 1min（強度20％，超聲 2s，停 1s），煮沸 5min，冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min，取上清液另一新的離心管中，加入等體積的酸性提取液使之中和，10000g 4 ℃離心 10min，取上清液冰上保存供測定 NADPH 含量。

二 、 測定步驟( 在 在 1.5mLEP  管中按下表依次加樣 ） ：

混勻，570nm 下比色。

注意事項
    1、若用比色皿測，沉淀用試劑七溶解后必須立即測。好加一個測一個。
    2、若用酶標(biāo)板測，也必須在測定時再加試劑七，加入 1000µL 試劑七溶解沉淀，混勻后，取 300µL 酶標(biāo)板中，立即測定。
    3、不可將試劑一、二、三和四混合后再加，必須分開加。

三 、NADP + 和 和 NADPH  含量的計算 ：
  （一）NADP+含量的計算
1、血清（漿）中 NADP + 含量計算
   NADP + 含量(µmol/L）= (測定管 OD 值-0.047）×376
2、組織中 NADP + 含量計算
   (1)按樣本蛋白濃度計算
NADP + (µmol/g prot）= (測定管 OD 值-0.047）×37.6÷樣本蛋白濃度（g/L）
   (2)按樣本鮮重計算
NADP + (µmol/g mass）= (測定管 OD 值-0.047）×37.6÷樣本鮮重（g/L）
3、細(xì)胞或細(xì)菌中 NADP + 含量計算
   (1)按樣本蛋白濃度計算
NADP + (µmol/g prot）= (測定管 OD 值-0.047）×37.6÷樣本蛋白濃度（g/L）
   (2)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算
NADP + (µmol/10 4 cell）= (測定管 OD 值-0.047）×37.6÷細(xì)菌或細(xì)胞（10 4 cell /L）
（二）NADPH 含量的計算
1、血清（漿）中 NADPH 含量計算
   NADPH 含量(µmol/L）= (測定管 OD 值-0.047）×855
2、組織中 NADPH 含量計算
   (1)按樣本蛋白濃度計算
    NADPH (µmol/g prot）= (測定管 OD 值-0.047）×85.5÷樣本蛋白濃度（g/L）
   (2)按樣本鮮重計算
   NADPH (µmol/g mass）= (測定管 OD 值-0.047）×85.5÷樣本鮮重（g/L）
3、細(xì)胞或細(xì)菌中 NADPH 含量計算
   (1)按樣本蛋白濃度計算
   NADPH (µmol/g prot）= (測定管 OD 值-0.047）×85.5÷樣本蛋白濃度（g/L）
   (2)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算
   NADPH (µmol/10 4 cell）= (測定管 OD 值-0.047）×85.5÷細(xì)菌或細(xì)胞密度（10 4  cell /L）。

輔酶ⅡNADP（H）含量試劑盒