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乳酸脫氫酶(LDH)活性檢測(cè)試劑盒 輔酶系列

貨號(hào)：BC0680

規(guī)格：50管/24樣

產(chǎn)品內(nèi)容：

提取液：30mL×1瓶， 4℃保存；

試劑一：液體25 mL×1瓶， 4℃保存； 

試劑二：粉劑×1支，-20℃保存，用時(shí)加入1.3 mL雙蒸水充分溶解備用，配好后可分裝成小管-20 ℃保存，可保存兩周，禁止反復(fù)凍融；

試劑三：液體25 mL×1瓶，4℃保存； 

試劑四：液體60 mL×1瓶，4℃保存；

丙酮酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液：液體1 mL×1支，4℃保存，2mmol/ml。

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

    LDH（EC 1.1.1.27）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是糖酵解途徑的末端酶，催化丙酮酸與乳酸之間的可逆反應(yīng)，伴隨著NAD⁺/NADH之間互變。

    LDH催化NAD⁺氧化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸進(jìn)一步與2, 4 - 二硝基苯肼作用生成丙酮酸二硝基苯腙，在堿性溶液中顯棕紅色，顏色深淺與丙酮酸濃度成正比。

試驗(yàn)中所需的儀器和試劑：

    可見分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣品測(cè)定的準(zhǔn)備：   

• 細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清，按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500-1000:1 的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次），8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
• 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積（mL）為1:5-10 的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
• 血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。
• 丙酮酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液：取100ml標(biāo)準(zhǔn)液，倍比稀釋1、0.5、0.25、0.125、0 mmol/ml，用2、1、0.5、0.25、0.125、0 mmol/ml標(biāo)準(zhǔn)液做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
•  

二、測(cè)定操作：

• 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)450nm，蒸餾水調(diào)零。
• 樣本測(cè)定（在EP管中加入下列試劑）

充分混勻，37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴15min

充分混勻，37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴15min

充分混勻，室溫靜置3min，450 nm下測(cè)定吸光度，樣品計(jì)算ΔA=A測(cè)定管-A對(duì)照管。每個(gè)測(cè)定管需要設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管測(cè)定值和濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，y為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，μmol/mL；x為對(duì)吸光度。

LDH活力單位計(jì)算：

1、計(jì)算樣品丙酮酸的含量，即將ΔA（x） 帶入回歸方程中，計(jì)算y 值（μmol/mL）

2、血清（漿）LDH活力的計(jì)算

單位的定義：每mL血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生1nmol丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。

LDH（U/mL）=y÷T×10³=66.7×y

3、細(xì)胞、細(xì)菌和組織中LDH活力的計(jì)算

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。

LDH（U/mg prot）= y÷T÷Cpr×10³ =66.7×y÷Cpr

需要另外測(cè)定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。

（2） 按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。

LDH（U/g鮮重）= y÷T÷W×10³ =666.7×y

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。

LDH（U/10⁴ cell）= y÷T÷500×10³ =0.133×y

T：反應(yīng)時(shí)間，15 min；Cpr：蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣品質(zhì)量，0.1g; 500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬；10³：1μmol/mL=10³nmol/mL。

乳酸脫氫酶(LDH)活性檢測(cè)試劑盒 輔酶系列