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細胞鐵含量檢測試劑盒說明書

可見分光光度法

貨號：BC5310

規格：50T/48S

產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

溶液的配制： 

1. 標準液：1 μmol/mL Fe³⁺標準液，臨用前取200μL 1 μmol/mL Fe³⁺標準液，加入200μL蒸餾水，充分混勻，配制成0.5μmol/mL標準液使用，現用現配。（實驗中每管需要100μL，為減小實驗誤差，故配制大體積。）

產品說明：

鐵元素是人體必須的微量元素之一，它是血紅蛋白、肌紅蛋白、細胞色素及其他酶系統的主要成分，幫助氧的運輸，促進脂肪氧化。缺乏鐵元素容易造成貧血、代謝紛亂，并影響機體的免疫功能。

鹽酸羥胺將細胞中的Fe³⁺還原成Fe²⁺，Fe²⁺在弱酸條件下與鄰菲羅啉形成橙紅色配合物，在510nm處有吸收峰，測定該波長吸光度即可計算鐵含量。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計、低溫離心機、可調式移液器、超聲破碎儀、1mL玻璃比色皿、蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

按照細胞數量（10⁴個）：提取液體積（mL）為1000~2000︰1的比例（建議500萬細胞加入0.5mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率200W，超聲3秒，間隔7秒，重復30次），于4℃，8000g離心10min，取上清待測。

若樣本為真菌、細菌等有細胞壁的微生物可以適當延長超聲時間。

二、測定步驟

1. 可見分光光度計預熱30min，波長調至510nm，蒸餾水調零。

2. 在1.5mL EP管按下表步驟加樣：

三、細胞鐵含量計算

1. 按細胞數目計算：

細胞鐵含量（ng/10⁴ cell）=（C標準液×ΔA測定÷ΔA標準）×V提取×10³×55.845÷500

=27.922×ΔA測定÷ΔA標準

2. 按蛋白濃度計算：

細胞鐵含量（ng/mg prot） =（C標準液×ΔA測定÷ΔA標準）×V提取×10³×55.845÷（Cpr×V提取）

= 27922.5×ΔA測定÷ΔA標準÷Cpr

C標準液：0.5μmol/mL Fe³⁺標準液；V提取：加入提取液體積，0.5mL；10³：單位換算系數，1μmol=10³nmol；55.845：Fe的相對原子質量，55.845ng/nmol；500：細胞數目，500萬；Cpr：蛋白質濃度，mg/mL。

注意事項：

1、 如果ΔA測定＜0.01，可適當加大樣本量后重新測定；如果測定管吸光值大于1，建議將樣本用蒸餾水適當稀釋后進行測定。注意同步修改計算公式。

2、 如果按蛋白濃度計算細胞鐵含量，需自行測定樣本上清蛋白濃度。

實驗實例：

1、 取500萬HePG2細胞加入0.5mL提取液進行超聲破碎提取，離心取上清后按照測定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測得計算ΔA測定=A測定-A空白=0.171-0.000=0.171，ΔA標準=A標準-A空白=0.573-0.000=0.573，按細胞數目計算含量得：

細胞鐵含量（ng/10⁴ cell）=27.922×ΔA測定÷ΔA標準=8.333 ng/10⁴ cell

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