單細胞蛋白分析是一條可以更深入的了解免疫應(yīng)答、信號傳導(dǎo)、靶向治療的途徑。微流控芯片和免疫分析的出現(xiàn)為單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)的研究提供了新平臺。單細胞免疫印跡法（scWB）是一種可對單細胞表面、胞內(nèi)和核內(nèi)蛋白質(zhì)進行多重檢測的方法。它結(jié)合了基于微芯片的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳方法（SDS-PAGE）和凝膠內(nèi)蛋白質(zhì)光捕獲及免疫探針方法。然而，由于原位免疫印跡的特殊性，scWB常常無法檢測低豐度的蛋白質(zhì)。凝膠內(nèi)免疫探測的成功在很大程度上取決于蛋白質(zhì)的固定化效率。目前，一種典型的光親和標(biāo)記二苯甲酮（BP）可以形成光敏性聚丙烯酰胺凝膠，已廣泛用于光捕獲和凝膠內(nèi)免疫探測儀中。然而，其光衍生的中間體目標(biāo)捕獲率低,且會導(dǎo)致目標(biāo)熒光信號模糊等問題。
為了克服單細胞免疫印跡方法中的信號背景增強這一瓶頸，近，有報道稱2-芳基-5-羧基四唑-賴氨酸的類似物是一種良好的光親和標(biāo)記材料，可用于蛋白質(zhì)靶標(biāo)的原位固定和特異性位點結(jié)合。在這些類似物中，（1-甲基-1H-吡咯-2-基）-2H-四唑-5甲酰胺（mPyTC）與傳統(tǒng)的光活化基團（包括芳基酮，芳基疊氮化物和二疊氮基）相比，在選擇性蛋白質(zhì)靶標(biāo)標(biāo)記中顯示出更強的特異性。
受這些工作的啟發(fā)，作者在此提出了一種合適的聚丙烯酰胺交聯(lián)四唑基團，作為一種高效率、高選擇性的光活性水凝膠用于凝膠內(nèi)蛋白質(zhì)的光固定化。
基本信息
題目：A Photoclick Hydrogel for Enhanced Single-Cell Immunoblotting
期刊：Advanced Functional Materials
影響因子：16.836
通訊作者：丁顯廷教授，謝海洋助理研究員
索萊寶合作產(chǎn)品：
產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品貨號 |
FITC-BSA | SF063 |
FITC-OVA | SF069 |
摘 要
單細胞免疫印跡法的研究進展引起了人們的廣泛關(guān)注，該方法有助于探索從癌癥發(fā)展到干細胞生物學(xué)等影響生物系統(tǒng)的細胞間變異。該文章報道了一種用于單細胞蛋白質(zhì)組分析的四唑功能化光敏感水凝膠。該凝膠利用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳作為分子篩基質(zhì)用于交聯(lián)免疫印跡凝膠內(nèi)的蛋白質(zhì)。在很短時間（60s）的長波長紫外線照射下，能有效地將電泳分離的蛋白質(zhì)捕獲到凝膠中，用于隨后的抗體原位孵育。文章利用該方法研究了不同藥物處理的GES-1/MGC803細胞系中糖蛋白細胞間表達的差異性。與單細胞免疫印跡法相比，應(yīng)用該光敏感凝膠可同時監(jiān)測約2000個細胞的蛋白質(zhì)表達水平，這些細微變化用傳統(tǒng)技術(shù)可能是檢測不到的。該凝膠具有良好的電泳分離能力、良好的蛋白質(zhì)光固定化效率、較低的自發(fā)熒光背景，其優(yōu)良性能使其在毛細管、微流控芯片原位免疫印跡分析中具有廣闊的應(yīng)用前景，為應(yīng)用單細胞免疫印跡分析技術(shù)研究低豐度蛋白的研究人員提供了解決方案。
研究內(nèi)容與結(jié)果
1、MMP凝膠的合成與特征
文章作者開發(fā)了用于SDS-PAGE和凝膠免疫印跡的四唑功能化聚丙烯酰胺（圖1）。首先以N-（3-氨基丙基）甲基丙烯酰胺為原料合成了功能性光捕獲產(chǎn)物2-（1-甲基-1H-吡咯-2-基）-2H-四唑-5-羧基羧酸。通過EDCl/HOBt催化的酰胺縮合反應(yīng)得到N-（3-甲基丙烯酰胺丙基）-2-（1-甲基-1H-吡咯-2-基）-2H-四唑-5-羧酰胺（MAP-mPyTC）（圖2a）。將合成的MAP-mPyTC與丙烯酰胺和N，N'-亞甲基雙丙烯酰胺共聚，形成mPyTC修飾的聚丙烯酰胺（MMP）凝膠。產(chǎn)生的凝膠可以通過光敏感加成反應(yīng)共價固定電泳分離的蛋白質(zhì)（圖2b）。基于以下考慮，MMP凝膠是理想的光敏感水凝膠：首先，四唑基具有較高的中間親電性，因此具有高效率光捕獲蛋白的特性。第二，光衍生的羧基腈亞胺中間體與近端親核試劑，導(dǎo)致O-N酰基轉(zhuǎn)移，從而產(chǎn)生特定的光加合物。后，當(dāng)親核試劑不可用時，光衍生的羧基腈亞胺中間體會迅速淬滅，限制自發(fā)熒光并降低背景。
圖1
MAP-mPyTC的紫外可見光譜在346nm處呈現(xiàn)一個峰值，是其的紫外激發(fā)波長。以此，用異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的牛血清白蛋白（BSA）評估了MMP凝膠固定光誘導(dǎo)蛋白性能。圖2c表明MMP在正常的電泳條件下，凝膠在不暴露于紫外線時仍保持穩(wěn)定性。圖2d表明只需要60s的紫外線照射MMP凝膠就能光固定蛋白質(zhì)。此外，MMP凝膠優(yōu)于先前報道BPMAC約85％的光捕獲效率。
作者進一步研究了固定光誘導(dǎo)蛋白的分子范圍，并通過結(jié)合各種分子量（BSA，卵清蛋白[OVA]，胰蛋白酶抑制劑[TI]和溶菌酶）的蛋白質(zhì)靶標(biāo)而擴大了靶標(biāo)庫。在60s內(nèi)成功捕獲了所有蛋白質(zhì)靶標(biāo)，并且在分子量較小的情況下，捕獲動力學(xué)遵循相同的指數(shù)模式（圖2e）。在條件下（紫外線激發(fā)時間：60s，MAP-mPyTC濃度：0.6mM），作者觀察到蛋白質(zhì)靶標(biāo)明顯固定在MMP凝膠上，效率分別為92.77±1.35％，分別為91.16±3.91％，86.45±2.81％和82.36±4.44％。
圖2
2、MMP凝膠的免疫印跡分離性能驗證
接下來，對MMP凝膠的性能進行了測試。掃描電子顯微鏡（SEM）圖像顯示凍干光敏感凝膠中清晰的多孔結(jié)構(gòu)（圖3a，左）。用Image J測量孔徑，結(jié)果表明MMP凝膠的孔徑與普通凝膠PA凝膠相似，而BP-PA凝膠的孔徑較小（圖3a，右）。然后，基于這一理論作者研究了MMP凝膠的分離性能，結(jié)果表明，在電泳過程中總丙烯酰胺濃度的變化（%T，凝膠孔徑的調(diào)整）要優(yōu)于篩選蛋白質(zhì)靶大小。與PA和BP-PA凝膠電泳相似，觀察到MMP凝膠電泳具有較好的分離分辨率（圖3b）。總的來說，在電泳30s后MMP凝膠顯示了五種物種的良好分離。
凝膠內(nèi)免疫檢測的另一個瓶頸是水凝膠自熒光干擾，這是用于檢測靈敏度低的原位免疫印跡方法一個主要的瓶頸。為了檢測自體熒光對檢測靈敏度的影響，以牛血清白蛋白作為驗證靶，用抗牛血清白蛋白一抗和相應(yīng)的二抗在凝膠中進行檢測。從熒光圖像中觀察到，BP-PA凝膠中的背景熒光信號明顯較高（圖3d）。而分析物MMP中條帶信號較強（圖3e），信噪比顯著提高（圖3f）。此外，選擇性更高的官能團顯著避免了非特異性的結(jié)合。
圖3
3、MMP凝膠scWB的性能測試
作者采用常規(guī)流程（圖4a）來確定scWB的穩(wěn)定性，同時使用MMP凝膠分析了GES-1-GFP/GES-1細胞系和MGC803-GFP/MGC803細胞系的生物樣本（圖4b，c）。結(jié)果顯示GES-1-GFP/MGC803-GFP組和陰性對照組與常規(guī)免疫熒光成像和流式細胞術(shù)的結(jié)果相似（圖4d），紫外線對光捕獲靶抗原無不良影響，與其他mPyTC衍生物介導(dǎo)的蛋白質(zhì)研究相一致。
P-糖蛋白（P-gp）是ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白超家族的成員外排蛋白，與化療耐藥有關(guān)。研究P-gp表達譜的細胞間差異有助于闡明耐藥的潛在機制。為進一步驗證所制備的MMP凝膠的對目標(biāo)蛋白的檢測能力，利用誘導(dǎo)劑（利福平）或抑制劑（維拉帕米）處理GES-1/MGC803細胞系，通過scWB對P-gp進行檢測其在細胞間的差異性。
Q-P-gp在MGC803腫瘤細胞中的表達高于GES-1正常胃粘膜上皮細胞（圖4e）。利福平誘導(dǎo)組和維拉帕米抑制組的P-gp在GES-1細胞中的表達有顯著差異。結(jié)果表明，MGC803腫瘤細胞比正常GES-1細胞具有更強的耐藥性，P-gp在GES-1細胞中的表達更易受到化學(xué)物質(zhì)的影響。基于MMP的scWB顯示的組間差異在傳統(tǒng)的免疫印跡分析中是觀察不到的。值得注意的是，在BP-PA凝膠中，維拉帕米治療組P-gp蛋白的熒光信號大多被光敏凝膠的背景熒光所掩蓋，但在MMP凝膠中卻可以清楚地觀察到（圖4f）。這些結(jié)果表明，作者提出的光敏感凝膠在單細胞分辨率下描繪了低豐度蛋白質(zhì)的表達水平，可以提供以往方法無法獲得的細胞間特異性。
圖4
研究結(jié)論與意義
綜上所述，該文章報道了一種mPyTC修飾的光敏感聚丙烯酰胺凝膠，克服了單細胞蛋白免疫印跡分析中背景熒光信號強的這一瓶頸。在單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，該方法無需熒光信號放大，即可定量分析低豐度蛋白質(zhì)（≈30000個蛋白質(zhì)分子）。利用光敏感丙烯酰胺凝膠，能夠同時監(jiān)測約2000個單細胞的蛋白表達水平，文章中分析了GES-1/MGC803細胞系P-糖蛋白表達的細胞間差異。本文所提出的光敏感水凝膠的優(yōu)點包括易于合成、良好的電泳分離能力、較高蛋白質(zhì)光固定效率、較低自熒光性，因此，可以用作毛細管和微流控原位免疫印跡分析的光活性聚丙烯酰胺凝膠的替代。
索萊寶產(chǎn)品亮點
相關(guān)產(chǎn)品
產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品貨號 |
FITC-BSA | SF063 |
FITC-OVA | SF069 |
牛血清白蛋白 BSA-Ⅴ | A8020 |
牛血清白蛋白 BSA(全組分) | A8010 |
Anti-GFP tag Monoclonal Antibody | K200047M |
Anti-GFP-Tag Polyclonal Antibody | K009323P |
羊抗小鼠IgG(純化) | SPA131 |
羊抗小鼠IgG(免疫血清) | SA131 |
羊抗兔IgG(純化) | SPA134 |
羊抗兔IgG(免疫血清) | SA134 |
優(yōu)級胎牛血清 | S9020 |
細胞融合胎牛血清 | 11061-8611 |
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