質粒是細胞內的一種環狀的小分子DNA,是DNA重組的常用載體,在DNA重組中,質粒或經過改造后的質粒載體可通過連接外源基因構成重組體。在質粒提取過程中,多數質粒粗提取物中含有三種構型的質粒:共價閉合環DNA(cccDNA)、質粒的兩條鏈沒有斷裂、超螺旋開環DNA(ocDNA)、質粒的一條鏈斷裂、松弛的環狀分子線形DNA(lDNA):質粒的兩條鏈均斷裂;線性分子質粒DNA的分子構型。
質粒小量提取的方法
1.將3~5ml菌液13,000rpm離心30秒收集沉淀(菌體)。 如果用1.5ml或2ml離心管則需反復離心2~3次。
2.倒掉上清,將沉淀(菌體)*懸浮于100μl懸 浮液(溶液I)中。上清要盡可能去除干凈,可用濾紙吸干。沉淀要 用混旋器*懸浮,否則將直接導致下一步的裂 解不*,進而影響質粒DNA的產量和純度。
3.加入150μl裂解液(溶液II),輕柔地顛倒混勻10 次左右,溶液逐漸變得粘稠、清亮。不可用混旋器劇烈振蕩,否則會使質粒DNA斷裂; 裂解時間不宜超過5分鐘,否則會造成染色體DNA 的污染及質粒DNA的產率降低。
4.加入150μl中和液(溶液III),輕柔地顛倒混勻10 次左右。 此時可見到白色絮狀的染色體DNA及細菌碎片。
5.13,000rpm離心8~10分鐘,將上清液小心轉入一 37個新的1.5ml離心管中,加入0.4ml純化樹脂(使 用前充分混勻),顛倒混勻3分鐘。此步是通過離心去除染色體DNA及細菌碎片,并使處于高鹽狀態下的質粒DNA與純化樹脂結合。
6.將純化樹脂及上清液的混合物吸入離心純化柱中,13.000rpm離心30秒,倒掉收集管中的廢液。
7.將離心純化柱重新套入廢液收集管中,加入600μl 80%異丙醇(或80%乙醇),13.000rpm離心1分 鐘,倒掉收集管中的廢液。 如果離心純化柱底部殘留有異丙醇(或乙醇),可 用濾紙吸干,否則將影響以后的酶促反應。此步 是洗滌質粒DNA中混有的雜質及鹽類。
8.重復第7步1~2次,盡可能將雜質去除。
9. 取出離心純化柱,將其套入一個干凈的1.5ml離 心管,開蓋放置2~3分鐘,將殘留的異丙醇(或乙 醇)揮發干凈。加入50μl TE緩沖液(若用于測序, 則加50μl超純水)于純化樹脂上,不能粘在管壁 上。室溫下放置3分鐘后,13,000rpm離心1分鐘。 此步是將純化樹脂上的DNA洗脫下來。如果對質粒DNA的需求量較大,則重復此步驟1~2次,這 樣可以獲得高產量的質粒DNA。TE緩沖液或無菌 超純水的用量視用戶對濃度的要求而定。離心純化柱放入離心管中,若蓋不上蓋子,亦沒有關系,可開蓋離心。
10.離心管中收集的液體即是洗脫下來的質粒 DNA,取1~2μl電泳(0.8%瓊脂糖,120V,15~ 20分鐘)檢測其純度并目測定量。 若發現有RNA 污染,可加入0.5μl RNase A (10mg/ml),37℃保溫30分鐘。此操作不影響其 后續實驗。
質粒小量提取注意事項
1、使用前請先檢查溶液Ⅱ和溶液Ⅲ是否出現混濁,如有混濁現象,可在37℃水浴中加熱幾分鐘,待溶液恢復澄清后再使用。溶液Ⅱ、溶液Ⅲ和漂洗液使用后應立即擰緊蓋子。
2、洗脫緩沖液體積不應少于50ul,體積過小影響回收效率;洗脫液的pH值對洗脫效率也有影晌,若需要用水做洗脫液應保證其pH值在8.0左右(可用NaOH將水的pH值調此范圍),pH值低于7. 0會降低洗脫效率,DNA產物應保存在-20℃,以防DNA降解。
3、如果所提質粒為低拷貝質粒或大于10kb的大質粒,應加大菌體使用量,使用5-10ml過夜培養物,同時按照比例增加溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的用量,吸附和洗脫時可以適當的延長時間,以增加提取效率。
4、DNA濃度及純度檢測:得到的質粒DNA純度與樣品保存時間、操作過程中的剪切力等因素有關。得到的DNA可用瓊脂糖疑膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度。 DNA應在OD260處有顯著吸收峰,OD260值為1相當于大約50ug/ml雙鏈DNA、 40ug/ml單鏈DNA。OD260/OD280比值應為1.7-1.9,如果洗脫時不使用洗脫緩沖液,而使用去離子水,比值會偏低,因為pH值和離子存在會影響吸光值,但并不表示純度低。
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