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人P16蛋白酶聯免疫檢測

閱讀:1676      發布時間:2010-10-18
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P16蛋白酶聯免疫檢測
 
使用前仔細閱讀本說明書。本酶聯免疫試劑盒是基于雙抗體夾心技術原理,來檢測人P16蛋白,只能用于研究用途,不得用于醫學診斷。
 
本試劑盒采用的是雙抗體夾心酶聯免疫吸附法(ELISA)測定樣品中人P16蛋白的水平。向預先包被了人P16蛋白克隆抗體的酶標孔中加入P16蛋白,溫育;洗滌后,加入HRP標記過的P16蛋白抗體。再經過溫育和洗滌,去除未結合的酶,然后加入底物AB,產生藍色,并在酸的作用下轉化成終的黃色。顏色的深淺與樣品中人P16蛋白的濃度呈正相關。
試劑盒組成

1
標準品(16μg/ml
0.5ml
7
顯色劑A液
6ml
2
標準品稀釋液
3ml
8
顯色劑B液
6ml
3
酶標包被板
12孔×8條
9
終止液
6ml
4
酶標試劑
6ml
10
說明書
1份
5
30倍濃縮洗滌液
20ml
11
封板膜
2張
6
樣品稀釋液
6ml
12
密封袋
1個

需要而未提供的試劑和器材
1.   37℃恒溫箱。
2.   標準規格酶標儀。
3.   精密移液器及一次性吸頭
4.   蒸餾水,
5.   一次性試管
6.   吸水紙
注意事項
1.   從2-8℃取出的試劑盒,在開啟試劑盒之前要室溫平衡少30分鐘。酶標包被板開封后如未用完,板條應裝入密封袋中保存。
2.   各步加樣均應使用加樣器,并經常校對其準確性,以避免試驗誤差
3.   建議所有標準品、樣本都做雙份檢測。如標本中待測物質含量過高,請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(n倍)后再按說明書操作進行測定,計算時請后乘以總稀釋倍數(×n×5)。
4.   嚴格按照說明書的操作進行,試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準.
5.   為避免交叉污染,要避免重復使用手中的吸頭和封板膜
6.   不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質前使用。
7.   底物B對光敏感,避免長時間暴露于光下。
洗板方法
手工洗板方法:甩掉酶標板內的液體;在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙,酶標板朝下用力拍幾次;將稀釋后的洗滌液少0.35ml注入孔內,浸泡1-2分鐘。根據需要,重復此過程數次。
自動洗板:如果有自動洗板機,應在熟練使用后再用到正式實驗過程中
標本要求
1不能檢測含NaN3的樣品,因NaN3抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。
2.標本采集后盡早進行提取,提取按相關文獻進行,提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗,可將標本放于-20保存,但應避免反復凍融
操作程序
1.   標準品的稀釋:(本試劑盒提供原倍標準品一支,用戶請按照說明自行在小試管中倍比稀釋):

8μg/ml
5號標準品)
120μl的原倍標準品加入120μl的標準品稀釋液
4μg/ml
4號標準品)
120μl5號標準品加入120μl的標準品稀釋液
2μg/ml
3號標準品)
120μl4號標準品加入120μl的標準品稀釋液
1μg/ml
2號標準品)
120μl3號標準品加入120μl的標準品稀釋液
0.5μg/ml
1號標準品)
120μl2號標準品加入120μl的標準品稀釋液

2.   分別設空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑,其余各步操作相同)、標準品孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品孔中加入稀釋好的標準品50μl;在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,然后再加待測樣品10μl(樣品終稀釋度為5倍)。輕輕晃動混勻,37溫育30分鐘。  
3.   棄去液體,甩干,每孔加滿稀釋后洗滌液,振蕩30秒,甩去洗滌液,用吸水紙拍干。如此重復5次,拍干。
4.   每孔加入酶標試劑50μl,空白孔除外。輕輕晃動混勻,37溫育30分鐘。  
5.   棄去液體,甩干,每孔加滿稀釋后洗滌液,振蕩30秒,甩去洗滌液,用吸水紙拍干。如此重復5次,拍干。
6.   每孔先加入顯色劑A50μl,再加入顯色劑B50μl,輕輕震蕩混勻,37避光顯色10分鐘.
7.   取出酶標板,每孔加終止液50μl,終止反應(此時藍色立轉黃色)。
8.   測定:以空白孔調零,在450nm波長下測量各孔的吸光度值(OD值)。測定應在加終止液后15分鐘以內進行。
9.   根據標準品的濃度及對應的OD值計算出標準曲線的直線回歸方程,再根據樣品的OD值在回歸方程上計算出對應的樣品濃度。也可以使用各種應用軟件來計算。應記住由于樣品稀釋了的,其實際濃度應該乘以總稀釋倍數。
操作程序總結
準備試劑,樣品和標準品
 


 

加入準備好的樣品和標準品,37℃反應30分鐘
 
 


 

洗板5次,加入酶標試劑,37℃反應30分鐘
 
洗板5次,加入顯色液A、B,37℃顯色10分鐘
 
加入終止液
 
15分鐘之內讀OD值
 
計算
 
檢測范圍:0.2μg/ml→10μg/ml
規格:    96T/
保存:    2-8
有效期:  6個月(2-8℃)。

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