人白介素8(IL-8)ELISA試劑盒說明書

本試劑盒僅供體外研究使用

預期應用

ELISA法定量測定人血清、血漿、細胞培養上清或其它相關生物液體中白介素8(IL-8/CXCL8)含量。

概述

白細胞介素（IL-8）是1987年首先在受脂多糖刺激的人單核細胞培養液上清中分離提純的一種堿基肝素結合蛋白，具有內源性白細胞趨化和活化作用，zui初命名為單核細胞源性中性細胞趨化因子（monocyte-drvived neutrophils chemotactic factor, MDNCF），1998年被正式統一命名為中性粒細胞活化肽/IL-8（NAP/IL-8）。IL-8屬于CXC型亞家族。又因其氨基酸*個半胱氨酸前有谷氨酸-亮氨酸-精氨酸而稱為ELR⁺-CXC型趨化因子。IL-8是一種可由多細胞來源的多功能趨化因子，其生物學功能無種屬特異性，除具有特異性使中性粒細胞離開血流游走到炎癥組織，脫顆粒，產生超氧陰離子，引起呼吸爆發外，還顯示出促血管生成的活性，可參與多種惡性腫瘤的轉移及血管生成。此外，IL-8對淋巴細胞和其它免疫細胞也有趨化和活化作用。

實驗原理

用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗IL-8/CXCL8抗體的微孔中依次加入標本或標準品、生物素化的抗IL-8/CXCL8抗體、HRP標記的親和素，經過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的IL-8/CXCL8呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。

試劑盒組成及試劑配制 

• 酶聯板：一塊（96孔） 
• 標準品（凍干品）：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為5,000 pg/ml，將其稀釋為1,000 pg/ml后，再做系列倍比稀釋(注：不要直接在板中進行倍比稀釋)，分別稀釋1,000 pg/ml，500 pg/ml，250 pg/ml，125 pg/ml，62.5 pg/ml，31.2 pg/ml，15.6 pg/ml，樣品稀釋液直接作為標準濃度0 pg/ml，臨用前15分鐘內配制。

如配制500 pg/ml標準品：取0.5ml（不要少于0.5ml）1,000 pg/ml的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。

• 樣品稀釋液：1×20ml/瓶。
• 檢測稀釋液A：1×10ml/瓶。
• 檢測稀釋液B：1×10ml/瓶。
• 檢測溶液A：1×120ul/瓶（1:100）臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋，稀釋前根據預先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100ul），實際配制時應多配制0.1-0.2ml。如10ul檢測溶液A加990ul檢測稀釋液A的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內配制。
• 檢測溶液B：1×120ul/瓶（1:100）臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。
• 底物溶液：1×10ml/瓶。
• 濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
• 終止液：1×10ml/瓶（2N H₂SO4）。
• 覆膜：1×5張 

標本的采集及保存 

• 血清：全血標本請于室溫放置2小時或4℃過一夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
• 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
• 細胞培養物上清或其它生物標本：請1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

注：以上標本置4℃保存應小于1周，-20℃或-80℃均應密封保存，-20℃不應超過3個月，-80℃不應超過6個月；標本溶血會影響zui后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測；高血脂的標本不需進行特殊處理，可直接檢測。

操作步驟

實驗開始前，請提前配制好所有試劑；試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應該做標準曲線。如樣品濃度過高時，均應用樣品稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。建議各實驗室在操作前*行預實驗以建立*稀釋倍數。

• 加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100ul，余孔分別加標準品或待測樣品100ul，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應120分鐘。

為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。

• 棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100ul（在使用前一小時內配制），37℃,60分鐘。
• 溫育60分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔，甩干（也可輕拍將孔內液體拍干）。
• 每孔加檢測溶液B工作液（同檢測A工作液） 100ul，37℃，60分鐘。
• 溫育60分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔，甩干（也可輕拍將孔內液體拍干）。
• 依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色（30分鐘內，此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。
• 依序每孔加終止溶液50ul，終止反應，此時藍色立轉黃色。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結果的準確性，底物反應時間到后應盡快加入終止液。
• 用酶聯儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后立即進行檢測。

注：

• 每次實驗留一孔作為空白調零孔（不同于空白孔），該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2N H₂SO4。測量時先用此孔調OD值至零。
• 嚴格按照規定的時間和溫度進行溫育以保證準確結果。所有試劑都必須在使用前達到室 溫。使用后立即冷藏保存試劑。
• 洗板不正確可以導致不準確的結果。在加入檢測溶液B或底物前確保盡量吸干孔內液體。為防止樣品蒸發，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內，酶標板加上蓋或覆膜，以避免液體蒸發；洗板后應盡快進行下步操作，避免酶標板長時間處于干燥狀態。
• 消除板底殘留的液體和手指印，否則影響OD值。
• 在儲存和溫育時避免強光直接照射。
• 未使用完的酶標板或者試劑，請于2-8℃保存。標準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據所需的量配置使用，請配置標準品及工作液，盡量不要微量配置（如吸取檢測溶液A時，一次不要小于10ul），以避免由于不準確稀釋而造成的濃度誤差；檢測液A、B，以及底物溶液在使用前，應置于37℃溫育30分鐘；請勿重復使用已稀釋過的標準品、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液。
• 建議檢測樣品時均設雙孔測定，以保證檢測結果的準確性。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水

紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內，浸泡1-2分鐘，根據需

要，重復此過程數次。
自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

特異性

    本試劑盒可同時檢測重組或天然的人白介素8(IL-8/CXCL8)，且與其它相關蛋白無交叉反應。

計算

  以標準物的濃度為橫坐標（對數坐標），OD值為縱坐標（普通坐標），在半對數坐標紙上繪出標準曲線（推薦使用專業制作曲線軟件進行分析，如curve expert 1.3），根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度，再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。

注意事項

• 洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。
• 一次加樣時間控制在5分鐘內，如標本數量多，推薦使用多道移液器加樣。
• 請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。
• 如標本中待測物質含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數。
• 在配制標準品、檢測溶液工作液時，請以相應的稀釋液配制，不能混淆。
• 底物請避光保存。

檢測范圍：15.6 pg/ml - 1,000 pg/ml

zui低檢測限：7.8 pg/ml

說明

• 只有全部使用USCNLIFE試劑才能保證檢測效果，因為所有試劑都是有關聯的，不能混用其他制造商的產品。只有嚴格遵守USCNLIFE試劑的試驗說明才會得到*的檢測結果。
• 在儲存及孵育過程中避免將試劑暴露在強光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發和污染，試劑避免受到微生物的污染，因為蛋白水解酶的干擾將導致出現錯誤的結果。
• 小心吸取試劑并嚴格遵守給定的孵育時間和溫度。請注意在吸取標本 / 標準品，酶結合物或底物時，*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會導致不同的 “預孵育”時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。而且，洗滌不充分將影響試驗結果。
• 試劑盒保存：短期（2周以內）以標簽上的標示為準，長期保存請將試劑全部保存于-20℃。
• 濃洗滌液會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。
• 剛開啟的酶聯板孔中可能會含有少許水樣物質，此為正常現象，不會對實驗結果造成任何影響。
• 中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準。
• 所有的樣品都應管理好，按照規定的程序處理樣品和檢測裝置。
• 有效期：6個月