人核因子κB(NF-κB)ELISA試劑盒使用說明書

本試劑盒僅供研究使用

檢測范圍：47 pg/ml - 3000 pg/ml

zui低檢測限：15 pg/ml

特異性：本試劑盒可同時(shí)檢測天然或重組的人NF-κB，且與其他相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。

有效期：6個(gè)月

預(yù)期應(yīng)用：ELISA法定量測定人血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清或其它相關(guān)生物液體中NF-κB含量。

說明 

1．試劑盒保存：-20℃（較長時(shí)間不用時(shí)）；2-8℃（頻繁使用時(shí)）。

2．濃洗滌液低溫保存會(huì)有鹽析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶。 

3．中、英文說明書可能會(huì)有不一致之處，請以英文說明書為準(zhǔn)。

4．剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會(huì)含有少許水樣物質(zhì)，此為正常現(xiàn)象，不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成任何影響。

實(shí)驗(yàn)原理

用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗NF-κB抗體的微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化的抗NF-κB抗體、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的NF-κB呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計(jì)算樣品濃度。 

試劑盒組成及試劑配制 

• 酶聯(lián)板(Assay plate )：一塊（96孔）。 
• 標(biāo)準(zhǔn)品（Standard）：2瓶(凍干品)。
• 樣品稀釋液(Sample Diluent)：1×20ml/瓶。
• 生物素標(biāo)記抗體稀釋液（Biotin-antibody Diluent）：1×10ml/瓶。
• 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液 （HRP-avidin Diluent）：1×10ml/瓶。
• 生物素標(biāo)記抗體（Biotin-antibody）：1×120μl/瓶（1：100）
• 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素（HRP-avidin）：1×120μl/瓶（1：100）
• 底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶。 
• 濃洗滌液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25倍。 
• 終止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。

需要而未提供的試劑和器材

• 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀
• 高速離心機(jī)
• 電熱恒溫培養(yǎng)箱
• 干凈的試管和Eppendof管
• 系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時(shí)，用多通道移液器

6. 蒸餾水，容量瓶等

標(biāo)本的采集及保存 

• 血清：全血標(biāo)本請于室溫放置2小時(shí)或4℃過一晚后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
• 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或將標(biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
• 細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

注：標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測。

標(biāo)本的稀釋原則：

首先通過文獻(xiàn)檢索的方式了解待測樣本的大致含量，確定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。只有稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi)，檢測的結(jié)果才是準(zhǔn)確的。稀釋的過程中，應(yīng)做好詳細(xì)的記錄。zui后計(jì)算濃度時(shí)，稀釋了“N”倍，標(biāo)本的濃度應(yīng)再乘以“N”。

標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為3000 pg/ml，做系列倍比稀釋后，分別稀釋3000 pg/ml，1500 pg/ml，750 pg/ml，375 pg/ml，187 pg/ml，94 pg/ml，47 pg/ml，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 pg/ml，臨用前15分鐘內(nèi)配制。

如配制1500 pg/ml標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml（不要少于0.5ml）3000 pg/ml的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。

生物素標(biāo)記抗體的稀釋原則：

臨用前以生物素標(biāo)記抗體稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔100μl），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl生物素標(biāo)記抗體加990μl生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制。

辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則：

臨用前以辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔100μl），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素加990μl辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液 的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制。

操作步驟

實(shí)驗(yàn)開始前，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭噭┗驑悠废♂寱r(shí)，均需混勻，混勻時(shí)盡量避免起泡。每次檢測都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如樣品濃度過高時(shí)，用樣品稀釋液進(jìn)行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。

• 加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100μl，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120分鐘。

為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

• 棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加生物素標(biāo)記抗體工作液 100μl（取1μl生物素標(biāo)記抗體加99μl生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制），37℃,60分鐘。
• 溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，200μl/每孔，甩干。 
• 每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液（同生物素標(biāo)記抗體工作液） 100μl，37℃，60分鐘。
• 溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，200μl/每孔，甩干。
• 依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時(shí)肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3-4孔顯色不明顯，即可終止）。
• 依序每孔加終止溶液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液。
• 用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行檢測。

注：

1. 用戶在初次使用試劑盒時(shí)，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到管底。

2. 每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2N H2SO4。測量時(shí)先用此孔調(diào)OD值至零。 

3. 為防止樣品蒸發(fā)，試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜。

4. 未使用完的酶標(biāo)板或者試劑，請于2-8℃保存。標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記抗體工作液、辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液請依據(jù)所需的量配置使用。請勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記抗體工作液、或辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液。

5. 建議檢測樣品時(shí)均設(shè)雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘。根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。
自動(dòng)洗板：如果有自動(dòng)洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中。

計(jì)算

以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對(duì)數(shù)坐標(biāo)），OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)），在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。 

注意事項(xiàng)

1. 當(dāng)混合蛋白溶液時(shí)應(yīng)盡量輕緩，避免起泡。

2. 洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。

3. 一次加樣時(shí)間控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。

4. 請每次測定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔。

5. 如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高，請先稀釋后再測定，計(jì)算時(shí)請zui后乘以稀釋倍數(shù)。

6. 在配制標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液工作液時(shí)，請以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。

7. 底物請避光保存。

8. 不要用其它生產(chǎn)廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。