蛋白（及酶）—小分子半抗原結合物的制備

    在臨床實驗室中，我們常常會遇到有關小分子物質如激素、治療藥物和毒品等的測定問題，而這些小分子通常分子量小于1 000，只是半抗原，僅有反應原性，沒有免疫原性，如像蛋白大分子一樣，將其直接免疫動物，不能得到小分子的抗體，只有將其先與載體蛋白相連接，組成*抗原免疫動物，才能得到特異的抗小分子抗體，然后才能建立相應的小分子的酶免疫測定方法。此外，由于小分子上抗原決定簇有限及空間位阻的原因，其在與特異抗體的結合時，一個小分子只能與一個抗體分子結合，因此，如使用ELISA方法測定小分子，通常只能應用競爭抑制模式，這就需要制備酶—小分子結合物。因此，要建立小分子物質的免疫測定方法，必須有一個制備蛋白—小分子半抗原結合物的過程。

    一、小分子的特性及蛋白載體的選擇

（一）小分子上與蛋白連接基團的選擇對所產生抗體的特異性的影響小分子為具有多種反應基團如氨基、羧基、醛基等的物質，這些基團既是其區別于與其相近似分子的特異性抗原決定簇之所在，也是其用于與蛋白分子的交聯的結合基團。因此，當這些基團與蛋白大分子結合后，再免疫動物所得到的抗體，往往特異性會有所降低，尤其是分子結構上相近似的小分子，如選用每種小分子物質*基團連接蛋白，則免疫動物后所得抗體的特異性就差，因為其特異的抗原決定簇在刺激動物機體抗體的生成中不起作用，而共同的基團所組成的抗原決定簇卻不受影響，激發機體的免疫應答而產生能結合具有此決定簇的所有近似小分子的抗體。因此，選擇相關小分子均有基團用于與蛋白分子的交聯，得到的抗體具有較好的特異性。此外，在小分子與載體蛋白之間加入一連接空間臂，也能改善所得抗體的特異性。

    （二）小分子與載體蛋白的分子比對抗體產生的影響

    對于免疫動物產生抗體來說，并不是載體蛋白上小分子越多越好，而是一定數量的小分子對免疫動物產生抗體來說是的，如使用牛血清白蛋白（BSA）作為載體蛋白，每分子結合8～25個小分子較為合適。

    （三）載體蛋白的選擇

    選擇適當的載體蛋白對于有效地免疫動物得到抗小分子抗體非常關鍵。zui常用的載體蛋白是與擬使用免疫動物不同種屬的動物血清白蛋白、戚鑰血藍蛋白（keyholelimpet hemocya—nin）、卵清蛋白及纖維蛋白原等。載體蛋白一般以其反應活性的基團如s—和。—氨基（pKa分別為10和8）、酚基、巰基（pKa為9）、咪唑（pKa為7）和羧基（pKa2～4）等，所謂的pKa為基團的一半處于質子化時的pH值。因此，pH值的變化會引起這些基團反應活性的改變，親核基團的非質子化形式具有反應性。

    二、用于小分子與蛋白交聯試劑的選擇

用于小分子與蛋白交聯的試劑可分為四大類，即①乙酰化試劑；②烷基化試劑；③氧化還原試劑；④親電子試劑。乙酰化試劑的通用公式為R-C（＝O）—X，源于羧基（—COOH）的活化，如醋酸酐或混合酸酐、N—羥琥珀酰亞胺酯（NHS）和S—乙酰琉基琥珀酸酐等。由于所涉及基團的pKa，在堿性條件下，乙酰化試劑主要與蛋白的氨基（去質子的賴氨酸）和酪氨酸殘基形成穩定，的衍生物，與半胱氨酸或組氨酸殘基形成不穩定的衍生物。修飾的酪氨酸殘基可用羥胺處理而再生。一般情況下，酸酐會迅速水解，因此，其乙酰化作用與試劑的水解之間處于競爭之中。烷基化試劑中重要的是馬來酰胺，交聯反應在較為溫和的堿性條件下（pH 7．0～8．5）進行。烷基化試劑的質子型是N—乙酰馬來酰胺和芳香基鹵化物，如DNFB或TDIC。氧化還原試劑如二硫化物很少用于交聯反應。親電子試劑中zui常用的是重氮鹽。

    交聯試劑也可按其在小分子與載體蛋白之間形成橋接的本質分類：①活化羧基（大多在小分子上）使其能與氨基反應的試劑，這是使用的交聯試劑；②能在兩個氨基之間形成橋接的試劑；③與酪氨酸或組氨酸殘基連接產生偶氮基的試劑。

    與蛋白之間交聯一樣，用于小分子和蛋白間交聯的試劑的濃度亦應較高，從而增加交聯物形成的可能性。可溶性相對差的試劑可置于5％～25％有機溶劑中。但不管使用何種交聯方法，都要盡可能避免載體蛋白本身的交聯，例如使用兩步交聯方法。如果小分子的羧基或氨基不是其特異性所必需的，則其可直接用于與蛋白的交聯，否則就需要在小分子上衍生此類基團。

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