ELISA檢測中常見的酶及底物

辣根過氧化物酶HRP

    HRPzui常用的色原底物有鄰苯二胺（OPD）、2，2’—吖嗪—（3—乙酰苯基噻唑磺酸—6）[2，2’—azino-di（3—ethylben2thiazolinesulphonicacid-6），ABTS]（雜環吖嗪）、四甲基聯苯胺（TMB）和4—氨基安替比林：苯酚耦聯底物對等。上述色原底物受HRP作用主要有兩種形式的反應：①氧化還原底物的氧化作用，如OPD、ABTS等；②一個氨基芳香劑與另一個芳香基化合物的氧化耦聯，如4—氨基安替比林：苯酚等。

    （一）氧化還原色原底物

    OPD被認為是HRPzui為敏感的色原底物之一，其在HRP的作用下，由過氧化氫（H₂0₂）

氧化而聚合成2，2’—二氨基偶氮苯（DAB）。在pH5．0左右時，DAB在波長450nm處有廣范圍的zui大吸收，當pH值降為1．0時，zui大吸收波長移動至492nm，同時摩爾消光系數變大，顯色加深（圖4—2）。因而常用強酸如硫酸或鹽酸終止反應。實際工作中，用強酸尤其是鹽酸終止反應后，顯色并不穩定，常隨時間增長而顏色加深，這是由于反應后剩余的過氧化氫繼續氧化OPD而產生非酶催化的DAB的結果。有人在強酸反應終止液中加入還原劑如亞硫酸鈉，因還原劑可迅速*地將剩余的過氧化氫還原而阻止了OPD的非酶氧化，結果顯色穩定，數十小時內不變，而且無需避光。OPD的缺點是其對機體具有致突變作用。由于OPD的不穩定性，現在的商品試劑盒中，OPD均以片劑或粉劑供應，臨用時再溶解于相應的緩沖液。

    在ELISA測定時，OPD色原底物的具體配方為①顯色底物溶液：在0．1mol／L枸櫞酸鹽緩沖液（pH5．0）中含20 mmol／L OPD和12 mmo!／L H₂0₂，或10 mmol／L OPD和5．5mmol／L H₂0₂；②終止液：2 mol／L硫酸（含0．1 mol／L亞硫酸鈉）；③測定波長：492nm。

    TMB是一種優于OPD的新型HRP色原底物。其氧化產物聯苯醌在波長450nm處有zui大消光系數，如果HRP量少，過氧化氫溶液和TMB過量時，則形成藍色的陽離子根。降低pH，即可使藍色的陽離子根轉變為黃色的聯苯醌（圖4—3）。使用硫酸作為終止劑可使產物穩定90min，但隨后本底顯色就不斷加深，國內有人認為使用1％SDS作為終止劑，可使鮮藍色24h內保持不變，陰陽性對比十分明顯，但在我們實驗室發現1％SDS對上述顯色有較強的褪色作用，目前仍以硫酸作為終止劑較為理想。ELISA中，底物反應顯色后，常選擇其具zui大吸收的波長450nm比色測定結果。而’Madersbacher和Berger等為提高以TMB作底物的ELISA測定的敏感性，選擇顯色呈指數加深時的波長405nm比色測定。他們首先測定一系列已知濃度的標準品在450nm和405nm的值，證實A450nm／A405nm之比為3．2，然后在使用波長405nm測定含低濃度待測物的標本得到的OD值再乘以常數3．2，即為待測標本在波長450nm處的真值。該種雙波長測定方法可使ELISA測定范圍提高3倍。TMB的顯色反應雖與OPD一樣同屬氧化還原反應，但前者的反應是可逆的，如終止液中存在還原劑（維生素C及亞硫酸鈉、SDS等），則可反應顯色迅速消退。TMB雖然溶解度相對較低，但由于其高檢測敏感性及無致突變作用，現已基本上取代了OPD而成為HRPzui為常的色原底物。

    在商品ELISA試劑盒尤其是國內的產品中，TMB色原底物常為已配好的A及B兩種液態試劑，其中一種是含一定濃度過氧化氫的溶液，一種為TMB溶液，鑒于過氧化氫、TMB在溶液中相對不穩定的特點，因此，我們在使用ELISA試劑盒時，如發現底物A和（或）B出現顏色，或二者各取一滴混合后顯色，說明該試劑盒的底物溶液已變質或已受污染，必須廢棄。

    在ELISA測定時，TMB色原底物的具體配方為①顯色底物溶液：先將TMB以0．1 mol／L的濃度溶于二甲亞砜，然后，再將其以1 mmol／L和H₂0₂以3．0 mmol／L的濃度溶于0．2mol／L醋酸鈉／枸櫞酸緩沖液（pH4．0），即可應用。②終止液：2 mol／L硫酸。③測定波長：450nm。

    ABTS也是HRP的一種高靈敏底物。在H：O：存在下，ABTS的氨鹽轉變為易發生歧化的陽離子根（圖4—4）。陽離子根為綠色，與OPD的黃色氧化產物相比更適于可見光測定（測定波長入＝414nm）。上述顯色也不穩定，10 mmol／L疊氮鈉是較為理想的終止劑，可使顯色穩定數十小時，且可減少陽離子根的歧化。另有人報道用1．25％NaF終止反應效果較好。

    ABTS在目前國內的ELISA試劑盒中基本上沒有應用，但在國外ELISA試劑盒偶見有應用。

    在ELISA測定時，ABTS色原底物的具體配方為①顯色底物溶液：先將ABTS以2 mmol／L和H₂0₂以2．5 mmo!／L的濃度溶于0．1 mol／L醋酸鹽緩沖液（pH 4．2），即可應用；②終止液：10 mmol／L疊氮鈉；③測定波長；414nm或405nm。

    除上述三種外，HRP的氧化還原底物尚有O-dianisidine（ODA），5—氨基水楊酸（5—AS）以及dicarboxindine等。

    （二）氧化耦聯色原底物對

HRP的氧化耦聯色原底物對主要有4—氨基安替比林：苯酚耦聯底物對（Trinder試劑）和2—甲基—2—苯并噻唑啉腙（MBTH）；二甲基苯胺（DMA）耦聯底物對（Ngo—Lenhoff試劑）等。

    在H₂0₂存在下，4—氨基安替比林和苯酚經HRP作用縮合形成紅色的醌亞胺，其在入＝492 nm處有zui大吸收（圖4—5）。

    該耦聯色原底物對用于固相ELISA時，敏感性一般較低，反應見光不穩定，而且苯酚易發生多聚化，缺乏適當的反應終止劑。因此，該試劑常限于葡萄糖、三酰甘油、肌酸激酶等臨床生化指標的酶法檢測應用。1989年日本學者用其作為色原底物建立了一種以HRP作標記酶的均相酶免疫試驗，可用甲醛終止反應。但這種方法僅停留在實驗室階段，其后也未見有其他實驗室的應用報道，可能還有其固有的缺陷。

    4—氨基安替比林：苯酚耦聯底物對色原底物的具體配方為①顯色底物溶液：將4—氨基安替比林以2 mmol／L，苯酚以25 mmol／L和H₂0₂以0．8 mmol／L的濃度溶于0．1 mol／L磷酸鹽緩沖液（pH7．2），即可應用；②終止液：未見報道；③測定波長：492nm。

    MBTH和DMA在HRP的作用下縮合生成紫藍色的吲達胺（indamine），zui大吸收波長為590nm，見光不穩定。用鹽酸或硫酸終止反應后，pH應為3．0左右，pH值的降低使顯色從紫藍色轉變為清晰的藍色，zui大吸收波長從590nm變為595nm，然而pH值的進一步降低，將導致光吸收消失。

    MBTH：DMA耦聯對在固相ELISA測定幾乎沒有應用。

堿性磷酸酶（AP）

    在ELISA測定中，堿性磷酸酶的色原底物zui常用的是對硝基苯磷酸鹽（p-nitropheny—

|phosate，pNPP）。pNPP在堿性磷酸酶的作用下生成對硝基酚（pNP），其在入＝405 nm處有zui大吸收.

    由于堿性條件下pNP的光吸收增強，并可使堿性磷酸酶失活，因而可使用碳酸鈉作為終止劑。二乙醇胺緩沖液中不能有單乙醇胺，因為單乙醇胺對堿性磷酸酶有溫度依賴的抑制作用。較高濃度的無機磷可競爭性地抑制堿性磷酸酶的活性，pNPP貯存時間過長由于非酶水解而產生硝基酚和磷酸鹽時即可出現這種情況，此時pNPP呈黃色。

    因此，用于ELISA測定時，pNPP必須五色。pNP的摩爾消光系數（光吸收）的變化取決于溶液的pH及溫度、離子強度、蛋白含量，當溫度從15~C升高至45℃時，pNP在入＝405 nm處的光吸收將增加5％～7％。

    在ELISA測定時，pNPP色原底物的具體配方為①顯色底物溶液：將pNPP以10 mmol／L的濃度溶于含1 mmol／LMgCl：的0．1 mol／L二乙醇胺緩沖液（pH 9．8），即可應用；②終止液：0．5 mol／L碳酸鈉；③測定波長：405nm。

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