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瓊脂糖凝膠電泳注意事項及操作流程
點擊次數：4200 發(fā)布時間：2021-8-26
那么下面上海金鵬分析儀器有限公司為大家簡單介紹一下關于瓊脂糖凝膠電泳注意事項及操作流程：
凝膠電泳操作注意事項：
1. 緩沖系統(tǒng)：在沒有離子存在時，電導率*小，DNA不遷移，或遷移極慢，在高離子強度的緩沖液中，電導很高并產熱，可能導致DNA變性，因此應注意緩沖液的使用是否正確。長時間高壓電泳時，常更新緩沖液或在兩槽間進行緩沖液的循環(huán)是可取的。
2. 瓊脂糖：不同廠家、不同批號的瓊脂糖，其雜質含量不同，影響DNA的遷移及熒光背景的強度，應有選擇地使用。
3. 凝膠的制備：凝膠中所加緩沖液應與電泳槽中的相一致，溶解的凝膠應及時倒入板中，避免倒入前凝固結塊。倒入板中的凝膠應避免出現氣泡，影響電泳結果。
4. 樣品加入量：一般情況下，0.5cm寬的梳子可加0.5ug的DNA量，加樣量的多少依據加樣孔的大小及DNA中片段的數量和大小而定，過多的量會造成加樣孔超載，從而導致拖尾和彌散，對于較大的DNA此現象更明顯。
5. 電泳系統(tǒng)的變化會影響DNA的遷移，加入DNA標準參照物進行判定是必要的。
6. DNA樣品中鹽濃度會影響DNA的遷移率，平行對照樣品應使用同樣的緩沖條件以消除這種影響。
7. DNA遷移率取決于瓊脂糖凝膠的濃度，遷移分子的形狀及大小。采用不同濃度的凝膠有可能分辨范圍廣泛的DNA分子，制備瓊脂糖凝膠可根據DNA分子的范圍來決定凝膠的濃度。小片段的DNA電泳應采用聚丙烯酰胺凝膠電泳以提高分辨率。
瓊脂糖加樣時候注意事項：
1、 用移液搶將樣品加至點樣孔。每孔點樣的體積一般少于25ul，因此吸取每一個樣品時，操作要穩(wěn)當且細心。
2、 常加一定量的蔗糖來增加樣品的濃度，以使每個樣品停留在各自的點樣孔中。
3、 在樣品中加入水溶性的陰離子追蹤染料（如溴酚藍），用以看出樣品移動的距離。
4、 在一個或幾個孔中加入標準分子質量樣品，電泳結束后，根據已知分子質量的帶的相應位置可用來做出標準曲線。
5、 電泳一般是在追蹤染料泳動到膠的80%部位時停止。注意電泳期間，電泳槽蓋要安全蓋好，以防止液體蒸發(fā)，又可以降低電擊的可能性。
6、 電泳結束后，將膠浸沒在1mg/L的溴化乙錠（EB）中，5min后即可看到DNA帶，EB通過插入在雙螺旋的配對核苷酸之間同NDA結合。另一種方法是電泳時，在膠中加入EB。
7、 在紫外燈下，由于EB發(fā)出強烈的橘紅色的熒光，所以可以看到DNA帶。利用這種方法檢測的界限是每條帶約10ng DNA。帶上塑料安全眼鏡可防止紫外光對眼睛的傷害。可用尺子來測量每條帶至點樣孔的距離。同樣，利用特制的照相機和調焦器，也可以對凝膠拍照。
8、 如果要對某一條帶（如質粒）進一步分析，可用小刀將含該帶的凝膠切割下來，從帶中回收DNA。
瓊脂糖核酸電泳實驗操作流程
1.用蒸餾水將制膠模具和梳子沖洗干凈，放在制膠平板上，封閉模具邊緣，架好梳子；
2.根據欲分離DNA片段大小用凝膠緩沖液配制適宜濃度的瓊脂糖凝膠：準確稱量瓊脂糖干粉，加入到配膠用的三角燒瓶內，定量加入電泳緩沖液（一般20~30 ml）；
3.放入到微波爐內加熱熔化。冷卻片刻，加入一滴熒光染料，輕輕旋轉以充分混勻凝膠溶液，倒入電泳槽中，待其凝固；
4.室溫下30~45分鐘后凝膠*凝結，小心拔出梳子，將凝膠安放在電泳槽內；
5.向電泳槽中倒入電泳緩沖液，其量以沒過膠面1mm為宜，如樣品孔內有氣泡，應設法除去；
6.在DNA樣品中加入10×體積的載樣緩沖液（loading buffer），混勻后，用槍將樣品混合液緩慢加入被浸沒的凝膠加樣孔內；
7.接通電源，紅色為正極，黑色為負極，切記DNA樣品由負極往正極泳動 (靠近加樣孔的一端為負)。一般60～100V電壓，電泳20～40min即可；
8. 根據指示劑泳動的位置，判斷是否終止電泳；
9.電泳完畢，關上電源，在凝膠成像儀上觀察電泳帶及其位置，并與核酸分子量標準Marker比較被擴增產物的大小。
瓊脂糖凝膠濃度與線形DNA的*佳分辨范圍
瓊脂糖凝膠濃度線形DNA的*佳分辨范圍（bp）
0.5%1,000～30,000
0.7%800～12,000
1.0%500～10,000
1.2%400～7,000
1.5%200～3,000
2.0%50～2,000
以上就是上海金鵬分析儀器有限公司為大家整理總結關于瓊脂糖凝膠電泳注意事項及操作流程。
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