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英文名稱:EndoFree plasmid ezFilter midi kit
中文名稱 :無內毒素質粒中量提取試劑盒
編號:PD1416-01
規格: 10次
品牌:biomiga
說明 : |
從15~50 mL菌液中純化200 μg無內毒素質粒DNA 試劑盒組分: Catalog # | PD1416-01 | Preps | 10 | EzBindTM Columns | 10 | Filter syringe (25 mL) | 10 | Buffer A1 | 30 mL | Buffer B1 | 30 mL | Buffer N3 | 40 mL | Buffer KB | 35 mL | EndoClean Buffer | 10 mL | RNase A (20 mg/mL) | 3 mg(150 μL) | Endofree Elution Buffer | 15 mL | User Manual | 1 | 保存條件: RNAse A在4℃下可以保存一年,Buffer A1加入RNase A 后4℃保存,其它組分室溫保存。 注意事項: - 質??截悢担杭兓械涂截惖馁|粒時,使用2倍的菌液體積,2倍的Buffer A1,B1,N3,100%乙醇,相同體積的70% 乙醇和Endofree Elution Buffer..
- 轉化菌: 若為-70oC甘油凍存的菌,請先涂布平板培養后,再重新挑選新的單個菌落進行培養。切勿直接取凍存在4oC的菌進行培養。
- 柱結合能力:250 μg。
- 對富含內源核酸酶的宿主菌(endA+)如HB101, JM101, TG1等,需去核酸酶,請使用產品PD1712。
操作簡明步驟: - 取50 µL新鮮的菌液接種到15-50 mL (勿超過 50 mL)的LB培養基(含適量抗生素),37oC震蕩培養14-16小時。室溫下5,000 x g離心10分鐘,收集菌體,并盡可能的吸去上清。
- 加入2.5 mL Buffer A1(確保已加入RNase A),用移液器或渦流震蕩確保細菌沉淀重新懸浮。
- 加入 2.5 mL Buffer B1, 輕輕地反轉5-10 次以混合均勻,然后靜置2-5分鐘至溶液粘稠而澄清。
- 加入600 µL Buffer N3, 立即反轉5次,用手用力搖晃3-5次充分混勻,此時出現白色絮狀沉淀。
- 將裂解液轉移至過濾器中,放在一個15 mL的試管上靜置10分鐘。管中的白色絮狀沉淀浮上來,對準15 mL的管向下壓,使裂解液盡可能多的通過,有些裂解液可能會殘留在沉淀中。注:靜置10 分鐘時RNase A將工作,排除RNA污染。
- 定量吸取離心后的上清液至新的15 mL管中(避免吸起沉淀),加入0.1 倍體積的EndoClean Buffer,混勻后冰浴10分鐘,其間不時搖勻(若EndoClean Buffer粘稠難吸,可將槍頭剪掉頭后再吸?。?/font>
- 室溫下(冰浴取出后務必使溶液溫度恢復到23oC以上,否則溶液不分層)13,000 x g離心10分鐘(也可在2,500 x g離心15 min)。此時溶液分為兩層,上層水相含有質粒,下層紅色有機相含有內毒素。
- 將上層水相轉移至一個新的15 mL管中,加入3 mL 的Buffer N3及3 mL的100% ethonal,用手用力甩5次以混勻,該混合溶液需要需馬上進行過柱吸附操作。
- 立即轉移6.0 mL裂解液至帶收集管的DNA柱中,室溫下> 2,500 x g 離心1分鐘,倒掉收集管中的廢液,將離心柱重新放回到收集管中。重復此步直至所有的溶液通過DNA柱。
- 可選: 向DNA柱中加入 3.0 mL Buffer KB, 室溫下> 2,500 x g 離心1分鐘,倒掉收集管中的廢液,將離心柱重新放回到收集管中。
- 向離心柱中加入5 mL 70% 乙醇,室溫下> 2,500 x g離心1分鐘,倒掉收集管中的廢液,將離心柱重新放回到收集管中。重復步驟“11”。
- 將離心柱放回高速離心機中,室溫下> 2,500 x g開蓋離心10分鐘,以*去除殘留的乙醇。
- 將離心柱轉至一個新的15 mL離心管中,向DNA柱膜的正中加入0.5 mL的Endofree Elution Buffer,室溫放置1分鐘,> 2,500 x g 離心5分鐘,以洗脫質粒DNA。若想提高得率,可用洗脫得到的0.5 mL的Endofree Elution Buffer。 再洗脫一次,收集到新的離心管中。
操作流程: |